基于白细胞介素8/黏蛋白5ac信号探讨益气活血化痰方对慢性阻塞性肺疾病大鼠气道重塑及平滑肌厚度的影响※

陈慧婷 王盛隆 白 丽

(山西省中西医结合医院肺病科,山西 太原 030013)

相关统计显示,我国每年死于慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的患者有近百万,致残人数近千万[1]。在国外,COPD也是致残及致死率前五的疾病[2]。COPD患者主要表现为气道慢性炎症及气流受阻,同时还伴有气道黏膜高分泌,使得气道狭窄,影响肺功能。白细胞介素8(IL-8)/黏蛋白5ac(MUC5ac)通路在气道高分泌发展中占有重要地位,可通过激活该通路,调控MUC5ac表达,影响气道黏液分泌。IL-8通过调控该通路中核转录因子κB(NF-κB)的表达调控炎性反应,并调控MUC5ac表达。COPD患者该通路异常活化,促进炎症反复发展,持续的气道炎症反应会促使气道狭小,支气管平滑肌厚度增加,影响肺功能[3]。目前,COPD的治疗常选用糖皮质激素类药物,具有一定的疗效,但该类药物具有毒副作用。此外,由于COPD病程久,易反复发作,使得患者的经济费用增加,最终导致患者的依从性低,不易长期使用。近年来,中医对COPD的治疗逐渐成为研究热点。COPD属中医学“肺胀”“喘证”“咳嗽”等疾病范畴,主要累及肺,兼及脾、心、肾。其病因主要为水停痰凝、气虚气滞、痰瘀互结,在后期则兼见肾虚的证候[4]。根据辨证,本实验运用益气活血化痰方对其动物模型进行治疗。既往研究已经证实,益气活血化痰方可抑制COPD模型动物IL-8等炎症因子的增加,下调肺组织MUC5ac、NF-κB等蛋白的表达,改善肺功能,减少COPD的复发。基于此,本研究基于IL-8/MUC5ac信号通路探讨益气活血化痰方对COPD大鼠气道重塑及平滑肌厚度的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD雄性大鼠53只,购自江苏艾菱菲生物公司,实验动物生产许可证号:SCXK(苏)2021-1012,体质量200～300 g,鼠龄6～8周,适应性饲养1周后进行实验。

1.2 实验药物 益气活血化痰方药物组成:南沙参、黄芪、桔梗、茯苓、法半夏、紫菀各15 g,杏仁12 g,水蛭、百合各9 g,甘草6 g。将药物煎煮3次后浓缩成浸膏,生药量3.2 g/mL。冰箱中保存。

1.3 实验试剂及仪器

1.3.1 实验试剂 白细胞介素8(IL-8)、IL-17、肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫吸附法试剂盒(武汉赛培生物科技有限公司,货号分别为:SP10233、SP10179、SP10205);IKB激酶2(IKK2)一抗(上海研生实业有限公司,货号:YS-YK00174);磷酸化IKB激酶α(p-IKBα)一抗(法国Covalab公司,货号:pab11292);NF-κB一抗(美国abclonal公司,货号:A15694);MUC5ac一抗(英国Abbexa公司,货号:abx106178);辣根过氧化物酶二抗(上海李记生物科技有限公司,货号:AP31L343);脂多糖(LPS)(北京伊塔生物科技有限公司,货号:YT1319);吡咯烷二硫代甲酸铵(PDTC)(上海翌圣生物科技股份有限公司,货号:52202ES50);戊巴比妥钠(上海新亚药业有限公司,国药准字H31021725);二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid,BCA)蛋白定量试剂盒(Pierce公司,货号:23225);苏木素-伊红(HE)试剂盒( 北京索莱宝科技有限公司,货号:G1120);磷酸盐缓冲液(PBS)(北京伊塔生物科技有限公司,货号:YT8386)。

1.3.2 实验仪器 PFT动物肺功能检测仪(美国DATA SCIENCES INTERNATIONAL公司),BK-1200全自动生化分析仪(山东BIOBASE公司),RT-6100酶标分析仪(雷杜生命科学股份有限公司),MAGICL6800全自动化学发光测定仪(南京基蛋生物科技股份有限公司),TDZ4-WS型低速离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司),SLK-O3000-S LED数显圆周摇床(美国赛洛捷克公司),DYCP-31E型电泳仪(上海新诺仪器设备有限公司),RV 10 digital V旋转蒸发仪(德国IKA公司),B203LED生物显微镜(重庆奥特光学仪器有限责任公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 分组及造模 于53只大鼠中随机抽取10只大鼠作为健康组进行对照,剩余43只大鼠根据文献[5]建立COPD模型:采用气管滴入LPS结合香烟(焦油含量:13 mg,烟碱含量:1.1 mg,每次10支)建模。将大鼠放置于80 cm×50 cm×40 cm的密闭箱内,于建模第1、14天在大鼠气管内滴入LPS 200 μg/200 μL,第2～13、15～60天,每天烟熏0.5 h进行建模。大鼠在出现食欲不振、持续腹泻后,随机抽取3只大鼠,处死后取肺组织进行HE染色,观察到大鼠支气管腔狭窄、肺泡壁断裂且有大量炎性细胞浸润视为建模成功。建模过程中无意外死亡,剩余40只大鼠运用数字随机表法分为模型组、中药组、抑制剂组、联合组,每组10只。

1.4.2 给药 中药组大鼠予益气活血化痰方32 g/kg灌胃,每日1次,连续给药28天;抑制剂组大鼠予腹腔注射100 mg/kg的IL-8/IKK/NF-κB/MUC5ac通路抑制剂PDTC,每日1次,连续给药28天;联合组予益气活血化痰方32 g/kg灌胃的同时腹腔注射PDTC 100 mg/kg,每日1次,连续给药28天;健康组、模型组正常饲养,不予干预。

1.5 观察指标及方法

1.5.1 肺功能指标 1%戊巴比妥钠麻醉大鼠后暴露气管,在气管软骨处做环形切口,接入三通管,并将该管与气管固定,采用动物肺功能检测仪测定用力肺活量(FVC)、呼气峰值流速(PEF)、第1 s用力呼气容积(FEV1)。

1.5.2 肺泡灌洗液炎症因子水平 将各组大鼠麻醉后,打开胸腔,将灌胃针头插入气管,运用0.9%氯化钠注射液冲洗肺部并收集肺泡灌洗液,酶联免疫吸附法检测肺泡灌洗液中IL-8、IL-17、TNF-α水平,将标准品进行稀释后加入酶标孔内,封孔孵育2 h,清洗后加入生物素化抗体工作液孵育1 h,清洗后加入10 μL酶结合物工作液孵育0.5 h,清洗后加入显色液,孵育20 min,加入终止液,混匀后检测450 nm处光密度(OD)值。

1.5.3 支气管平滑肌厚度 根据文献[6]测量支气管平滑肌厚度。运用Image-Pro Plus 6.0软件进行测量,实验步骤严格按照说明书进行。以单位长度的平滑肌层面积(WAsm/Pi,μm2/μm)表示平滑肌层厚度。

1.5.4 蛋白免疫印迹法(Wb)检测各组大鼠肺组织IKK2、p-IKBα、NF-κB、MUC5ac蛋白表达 取各组大鼠肺组织,剪碎后研磨,裂解液裂解,离心后取上清,BCA法测定蛋白浓度。取20 μg总蛋白于SDS缓冲液中,煮5 min后,进行电泳,后转入PVDF膜上,加入5%脱脂奶粉,封闭2 h,后加入IKK2、p-IKBα、NF-κB、MUC5ac一抗(1∶200),孵育过夜,PBS清洗后,加入辣根过氧化物酶二抗(1∶1000),封闭2 h,后PBS清洗。采用增强化学发光法(ECL)检测蛋白表达。运用凝胶成像系统对蛋白条带进行分析。

1.5.5 HE染色观察各组大鼠肺组织病理形态 取各组大鼠肺组织,多聚甲醛固定,脱水,包埋,切片,二甲苯脱蜡,乙醇脱水后烘干,苏木精染色10 min,盐酸(1%)处理,伊红复染,乙醇脱水,封片后使用生物显微镜(×200)观察肺组织病理形态。

2 结果

2.1 各组大鼠肺功能水平比较 与健康组比较,模型组、中药组、抑制剂组、联合组FVC、PEF、FEV1水平均降低(P<0.05);与模型组比较,中药组、抑制剂组、联合组FVC、PEF、FEV1水平均升高(P<0.05);联合组FVC、PEF、FEV1水平均高于中药组、抑制剂组(P<0.05)。中药组与抑制剂组组间各项指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠肺功能水平比较

2.2 各组大鼠肺泡灌洗液IL-8、IL-17、TNF-α水平比较 与健康组比较,模型组、中药组、抑制剂组、联合组肺泡灌洗液IL-8、IL-17、TNF-α水平均升高(P<0.05);与模型组比较,中药组、抑制剂组、联合组肺泡灌洗液IL-8、IL-17、TNF-α水平均降低(P<0.05);联合组肺泡灌洗液IL-8、IL-17、TNF-α水平均低于中药组、抑制剂组(P<0.05)。中药组与抑制剂组组间各项指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠肺泡灌洗液IL-8、IL-17、TNF-α水平比较

2.3 各组大鼠支气管平滑肌厚度比较 与健康组比较,模型组、中药组、抑制剂组、联合组支气管平滑肌厚度均增加(P<0.05);与模型组比较,中药组、抑制剂组、联合组支气管平滑肌厚度均降低(P<0.05);联合组支气管平滑肌厚度低于中药组、抑制剂组(P<0.05)。中药组与抑制剂组组间支气管平滑肌厚度比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠支气管平滑肌厚度比较

2.4 各组大鼠肺组织IKK2、p-IKBα、NF-κB、MUC5ac蛋白表达比较 与健康组比较,模型组、中药组、抑制剂组、联合组肺组织IKK2、p-IKBα、NF-κB、MUC5ac表达均升高(P<0.05);与模型组比较,中药组、抑制剂组、联合组肺组织IKK2、p-IKBα、NF-κB、MUC5ac表达均降低(P<0.05);联合组肺组织IKK2、p-IKBα、NF-κB、MUC5ac表达均低于中药组、抑制剂组(P<0.05)。中药组与抑制剂组组间各项指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、表4。

健康组 模型组 中药组 抑制剂组 联合组

表4 各组大鼠肺组织IKK2、p-IKBα、NF-κB、MUC5ac蛋白表达比较

2.5 各组大鼠肺组织病理形态 健康组大鼠肺组织结构完整;模型组大鼠肺组织支气管腔狭窄,肺泡壁断裂,有大量炎性细胞浸润;中药组、抑制剂组肺泡的病理情况有较大改善,但仍有部分炎性细胞浸润;联合组仅存在肺泡壁比健康组稍薄的情况,支气管腔、肺泡腔大小、内部纤毛均恢复正常,炎性细胞浸润较少。见图2。

图2 各组大鼠肺组织病理形态(HE,×200)

3 讨论

气道黏液高分泌状态与炎症因子联系密切,IL-8/MUC5ac通路具有调控炎症因子的作用,IL-8为该通路的上游因子,在疾病中,IL-8水平增加可刺激IKK2活化,活化的IKK2通过磷酸化IKBα激活NF-κB,进一步促进炎症发展,导致气道分泌MUC5ac增多,气道黏液的分泌增加,加速炎性反应,出现级联效应,最终形成COPD。另外,吸烟也是COPD产生的重要原因,吸烟会导致MUC5ac增多,气道黏液分泌增加,造成气道狭窄,肺功能降低。

近年来,中医逐渐成为治疗COPD的热点。中医学认为,COPD的病因是“痰”和“瘀”,同时也是致病因素。肺气虚,则痰湿内生,从而闭阻气道;肺主气,病邪久留不除,则肺气更加虚弱,进而导致气虚、气滞;气滞则血瘀,痰瘀互结,则肺脏虚衰[7]。此外,香烟烟雾的吸入也可损伤肺脏,这也是本病发病的一个重要诱发因素。香烟燃烧后的烟雾中会产生大量的有毒物质,结合现代医学研究的观点[8],认为香烟烟雾属于传统中医理论中“毒”的范畴。烟毒长期薰蒸肺脏,炼液为痰,使肺叶焦痿、肺气阴受损,出现咳嗽、咯痰、咯血等症状;烟尘等异物直接吸入,沉积于肺,耗损肺气、伤及肺阴,阻碍气机运行,久则瘀血内阻。从总体上看,其病位在肺,涉及脾、心、肾三脏。该病主要病因为水停痰凝,气虚气滞,痰瘀互结。治疗应以益气、活血、化痰为主。文中所用药方以南沙参、黄芪、桔梗、紫菀、杏仁、甘草、百合为基本方,方中南沙参、黄芪补元固气;桔梗、紫菀、杏仁温肺下气;甘草、百合益气补中,养阴润肺;法半夏行气化痰;水蛭可破血逐瘀;茯苓健脾利水渗湿。

有研究表明,沙参、黄芪、茯苓等成分可有效抑制患者机体的炎性反应,降低IL-8、IL-17、TNF-α等炎症因子水平,调节机体免疫功能[9];益气活血化痰中药可有效抑制IL-8、NF-κB p65等水平,进而抑制气道炎症并提升COPD患者肺功能及免疫功能[10]。此外,韩敏等[11]研究中发现,PDTC可通过抑制NF-κB核转位降低细胞内容物乳酸脱氢酶水平,提示PDTC可通过抑制NF-κB信号通路提升细胞存活比例,降低急性心肌梗死患者的心肌细胞凋亡程度,从而保护损伤的组织。Zhang Y等[12]研究发现,通过给酮症奶牛注射PDTC可有效降低其中性粒细胞中Toll样受体的表达水平,并抑制IL-6、IL-1β和TNF-α等炎症因子的合成与分泌,证实PDTC可有效抑制炎性反应发生,有较好的抗炎效果。以上提示益气、活血、化痰类方药能不同程度抑制各类肺病中的NF-κB、IL-8、TNF-α等炎症因子的释放,对COPD患者也有类似的治疗作用。本实验中的益气活血化痰方具有益气活血、化痰止咳的作用。而PDTC能够通过抑制NF-κB通路保护并修复损伤的肺组织,二者联合对于抑制COPD患者炎症效果更佳。本研究结果显示,益气活血化痰方可显著抑制大鼠肺泡灌洗液IL-8、IL-17、TNF-α水平,减少气道黏液的分泌,改善肺组织病理变化,恢复肺功能;另外蛋白免疫印迹检测结果显示,益气活血化痰方还可抑制肺组织IKK2、p-IKBα、NF-κB、MUC5ac蛋白表达,从而抑制IL-8/MUC5ac的异常活化,最终达到缓解和治疗COPD的目的。

目前对于COPD的治疗,主要从抑制气道重塑方面入手。气道重塑主要表现在气管平滑肌细胞异常增加,造成气管管腔狭窄,影响预后[13]。在COPD发病过程中,炎症因子释放增加,加重了气道黏膜的炎症状态,使得黏膜下的胶原沉积过多以及平滑肌细胞异常增加,气道平滑肌细胞增殖,使气道收缩强烈以及气道壁增厚,从而使气道狭窄,气流阻塞,形成COPD[14]。在COPD发生时,IL-8/MUC5ac通路高度活化,高表达的IL-8会促进MUC5ac活化,促进炎症发展,炎症刺激导致气管壁反复损伤,进而导致胶原增生、平滑肌增厚及瘢痕形成等,导致气管重塑[15]。PDTC可有效降低肺组织中IKK2、p-IKBα、NF-κB、MUC5ac蛋白表达,进而抑制细胞外胶原增生,保护受损的气管内壁。本研究结果显示,经益气活血化痰方联合PDTC治疗后,大鼠支气管平滑肌厚度显著降低,这提示益气活血化痰方加PDTC可有效改善COPD的气道重塑,这可能是通过调控IL-8/MUC5ac通路活化,抑制炎性反应完成的。

综上所述,益气活血化痰方干预COPD模型大鼠可通过抑制IL-8/MUC5ac通路活化,抑制炎症反应,降低气管平滑肌厚度,抑制气道重塑,改善肺功能。