HIV-1免疫印迹试验不确定/阴性样本病毒载量检测结果分析

李梅 袁薇,△ 杨敬源 刘勇

(1.贵州医科大学,贵州 贵阳 550025;2.贵州省临床检验中心,贵州 贵阳 550002)

免疫印迹蛋白法(western blot,WB)是诊断艾滋病感染的确证试验之一[1],但由于急性期/早期HIV感染者处于窗口期其体内抗体滴度较低、晚期艾滋病患者消耗了大量抗体、老年人免疫失衡产生交叉性抗体等原因[2-3],容易出现抗体不确定的结果,导致WB不确定样本的感染者诊断被延迟。病毒载量(Viral Load,VL)试验具有高灵敏性和高特异性,检测结果窗口期短于WB,适用于初筛有反应性,WB抗体不确定/无特异性条带及流行病学史有意义的样本检测,其结果已经被作为HIV感染的诊断依据之一[4]。本研究对HIV-1抗体不确定/阴性样本补充VL检测,为及时诊断HIV感染提供参考。报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2021年1月-5月贵州省2个市(州)初筛实验室抗体筛查有反应性的血清样本,经贵州省临床检验中心艾滋病确证实验室进行WB,诊断为HIV-1抗体不确定样本进行HIV-1核酸定量实验检测,并收集样本个案信息,包括年龄,性别等。本研究通过贵州省临床检验中心伦理委员会批准(编号:2021001)。

1.2研究方法

1.2.1HIV-1抗体补充试验 免疫印迹蛋白法(WB):仪器为瑞士Te Can免疫印迹仪、德国CY blot蛋白印迹仪、英国Bee Blot48全自动免疫印迹仪。试剂盒来源于上海英旻泰(IMT)生物技术有限公司和德国麦克莱金公司生产的人类免疫缺陷病毒(HIV1+2型)抗体确证试剂。

1.2.2HIV-1VL检测 使用StreamSP96全自动核酸提取仪和ABI7500扩增仪,人类免疫缺陷病毒(HIV1+2型)核酸提取试剂和扩增试剂均来源于中山大学达安基因股份有限公司。

1.2.3结果判定 实验结果按照《全国艾滋病检测技术规范》(2020年修订版)和试剂盒说明书进行判定,实验过程严格遵守标准操作程序进行,每批次VL试验均进行室内质量控制,定期参加国家临床检验中心室间质评,结果合格。(1)IMT试剂结果判定:①阴性:无病毒特异性条带出现;②阳性:有以下两个或更多的条带显著存在:gp160/gp120、gp41、p24,其他的HIV-1蛋白条带可能出现也可能不出现;③不确定:既不符合阳性条带模式,又不符合阴性条带模式标准的任意条带。(2)麦克莱金试剂结果判定:①阴性:无检测线≥临界值、gp120或/和gp105≥临界值;②阳性:同种HIV类型的两个ENV检测线≥临界值(gp120+gp41或者gp105+gp36)、1个ENV检测线(仅gp41或者gp36)和至少1个GAG检测线(p24、p17)或1个POL检测线(p31、p51)≥临界值;③不确定:根据条带结果无法做出阴性或者阳性的判断。(3)VL最低检测线为250copies/mL。VL>5 000 copies/mL即可判断为HIV感染、低于检测下限和未检出不能排除HIV感染。

1.3统计学方法 使用Excel2016对数据整理和输入,实验结果用SPSS20.0进行统计学分析。检验水准α=0.05,单侧检验,定性资料使用χ2检验和Fisher确切概率法,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1WB检测结果分析 1 440例HIV初筛有反应性的样本经过WB检测,HIV抗体阳性1 142例、阴性159例、不确定139例。从性别分布来看,男性初筛阳性有953例,WB确诊阳性率85.4%(814/953);女性初筛阳性487例,WB阳性率为66.7%(325/487)。根据样本信息将年龄分为4组,从年龄分布来看,WB确证阳性的感染者年龄在4～87岁之间,50～75岁之间检测出HIV感染人数最多,25～50岁年龄组之间次之,小于25岁和大于75岁HIV感染者较少,分别只有53例和76例。<25岁年龄组WB确证阳性率为52.0%低于其他组,但阴性率确明显高于其余各年龄组,差异有统计学意义(χ2=25.9,P<0.01)。见表1。

表1 不同性别、年龄段初筛阳性样本的WB确证情况

2.2139例HIV-1抗体不确定带型及VL值分布情况 139例不确定样本带型以p24占50.4%(70/139)、p17占14.4%(20/139)、p24+p17占12.2%(17/139)为主,这3种类型在所有带型中共占77%(107/139)。对139例抗体不确定样本进行VL试验,36例可判定为HIV感染所占比例达25.9%、1例VL<5 000 copies/mL和102例未检出。36例诊断为HIV感染的不确定带型分别是:p24占58.3%(21/36)、p24+p17占22.2%(8/36)。102例VL未检出不确定带型p24占51.0%(52/102)、P17占19.6%(20/102)。1例低于检测下限带型为P24+P17。36例VL>5 000 copies/mL的阳性样本中,VL高于检测上限(>1×108copies/mL)2例,86.15%(31/36)的不确定样本VL值范围为1×105～1×108copies/mL。不确定样本中男性出现阳性比例高于女性,差异有统计学意义(χ2=11.4,P<0.01)、以50岁为感染HIV医学晚年年龄分组,≥50岁以上人群阳性占比高于50岁以下人群(χ2=11.3,P<0.01)。见表2。

表2 139例不确定样本不同性别,年龄阳性率差异

2.3IMT试剂WB阴性样本VL分布及VL>5 000 copies/mL样本使用麦克莱金试剂检测结果分析 159例WB阴性样本经VL检测,有153例(96.2%)VL未检出,6例(3.8%)VL>5 000 copies/mL,判断为HIV感染。对这6例样本使用麦克莱金人类免疫缺陷病毒(HIV1+2型)抗体确证试剂盒进行检测,有5例样本条带判定为阴性、1例样本gp41检测值≥临界值,两种试剂检测结果的一致性较好。见表3。

表3 6例IMT阴性样本使用麦克莱金试剂复核结果判定情况

2.4追踪139例抗体不确定者的转归情况 139例抗体不确定样本追踪到22例(15.8%),随访时间为2～24周,其中10例VL>5 000 copies/mL 样本,随访后WB检测结果转阳;6例VL未检出样本,WB结果转为无特异性条带;6例VL未检出样本,其WB带型无进展,随即对这6例样本再次进行VL检测,VL值均为未检出,结合2次WB带型和2次VL检测结果、电话回访询问其流行病学史等因素分析,最终排除了这6例样本HIV感染的可能性。

3 讨 论

本研究发现,男性HIV阳性检出率高于女性,该结果与刘建礼研究结果类似[5],也符合贵州省艾滋病疫情流行分布[6],25岁以下人群阳性率低于其他年龄组,阴性率也明显高于其他年龄组,推测这可能是年轻人更容易到接受健康教育,认识到合理使用安全套有利于预防艾滋病感染,危险性行为后主动寻求检测有关。本研究中不确定带型以p24出现的比例较高,这与有关报道一致[7-8],单独的p24条带存在于随访后WB转阳的样本中,提示可能为早期感染的带型[9],p24在VL未检出时也会大量出现,推测存在特异性反应[3-4,9],另外专业检测技术人员判读条带习惯也是p24带型过多的原因之一,因此无法通过p24带型预测WB不确定样本的归转情况。此外,本研究显示,WB不确定样本经VL检测后,发现50岁及以上人群WB不确定样本阳性检出比例高于50岁以下人群,提示年龄可能是影响WB不确定结果的重要因素之一,该结论与黎雅娟研究道相似[10],目前我国老年人艾滋病感染率已经达到1.68%,高于全人群HIV感染率0.058%[11],随着我国老年人群性观念逐渐开放,发生危险性行为时更容易引起HIV传播或感染[12],未来50岁以上老年人群或将成为艾滋病检测、监控、防治重点人群[13]。因此,为了老年人晚年生存质量有保证,当该人群WB结果为不确定,随访时应将该人群作为重点人群加以关注或直接进行VL检测。

HIV感染人体后,病毒开始大量复制、而抗体的产生需要一定时间[14],在急性感染窗口期未产生足够抗体或者艾滋病晚期抗体即将消耗殆尽时WB表现出HIV-1抗体不确定结果[15],对不确定样本可选择进行核酸试验或者2～4周以后随访WB检测[1]。鉴于我国不同地区艾滋病流行强度,受检人群感染率不同,通过VL检测WB不确定样本判断为HIV感染的比例也各有不同,本研究中139例不确定样本中病毒载量试验VL>5 000 copies/mL占比25.9%,与朱晓娟等人研究结果相似[16],高于田文等人研究的结果3.96%[17],说明在不确定样本中进行VL检测确实可提高HIV感染确诊率,及时发现HIV感染者,避免漏诊造成HIV进一步传播。本研究随访到位比例为15.8%,虽略高于其他研究10.26%[17],但仍处于较低水平,一方面是HIV受检者人员流动性大,对其进行随访追踪存在一定局限性,另一方面是VL确诊后部分单位不再继续送样进行WB检测。

WB阴性结果如果疑似“窗口期”感染或者有流行病学史、建议核酸或者随访。本研究首次在贵州省部分市(州)对所有WB抗体阴性结果开展核酸定量检测试点工作,评价病毒载量试验对WB阴性样本诊断价值,为相关人员及时判定受检者感染情况提供数据参考,最大程度避免漏诊对个人和社会造成影响。同时对IMT试剂结果阴性、VL高值的样本用麦克莱金HIV抗体诊断试剂盒进行WB复检,排除了试剂影响因素。本研究中检测到3.7%(6/159)WB帯型阴性、VL值是高病毒载量的样本,在未经诊断后治疗的情况下,这常见于感染后病毒非常活跃的窗口期,若无法及时对此类HIV感染者进行干预,这可能导致HIV感染者自身疾病进展迅速,无形中引起更危险的隐匿传播,不利于艾滋病防治工作开展。比较WB和VL两种检测方法可发现,首先,WB随访结果虽然可作为HIV-1抗体不确定/阴性样本金标准,但追踪时间跨度大,随访率不高;其次,仅仅依靠WB检测结果,WB带型阴性实际VL是高病毒载量值感染者极容易被忽视,无法准确知晓自身感染情况,亦无法及时治疗。值得注意的是,核酸定量检测有时也会出现假阳性结果[18-19],当病载值低于检测下限或者VL<5 000 copies/mL,此类检测结果加以重视,再次进行复核。

综上所述,为了更早、更准确的诊断HIV感染,及时发现HIV感染者,减少二代传播,避免WB检测技术窗口期造成漏诊,在WB判定为不确定/阴性结果时应联合HIV-1核酸定量检测,对最终结果进行综合判定,与WB检测结果形成互补。