凝血功能及机体免疫功能与肺炎严重程度的相关性分析

李明伟 肖慧芳 冯玉龙

1河南省职工医院药学部，郑州 450002；2河南省职工医院老年医学二科，郑州 450002

肺炎是由支原体、细菌、病毒等感染引起的肺实质炎症，临床表现为胸闷、鼻塞、咳嗽。机体细胞因子、凝血功能淋巴细胞亚群与肺炎的发病和发展密切相关，但是其中的关系尚不清楚［1-2］。因此，明确肺炎与机体炎性反应、凝血纤溶功能、淋巴细胞亚群的关系具有重要的临床意义。本文利用流式细胞仪与血栓弹力图测定不同感染程度的肺炎患者凝血功能、细胞因子、淋巴细胞亚群的指标变化情况，探讨凝血功能、细胞因子、淋巴细胞亚群与肺炎严重程度的相关性，为临床诊疗肺炎提供参考。

资料与方法

1.一般资料

本文为试验研究。选取2021年1月至2022年12月于河南省职工医院就诊的肺炎患者80例，根据急性生理学和慢性健康状况评价Ⅱ（APACHEⅡ）评分［3］，其中危重型及以上（APACHEⅡ评分≥12分）36例，非危重型（APACHEⅡ评分＜12分）44例，男42例、女38例，年龄30～70（52.65±7.32）岁，病程2～14（5.58±1.32）d；另选择健康中心体检者50例作为对照组，男27例、女23例，年龄（55.21±5.53）岁。纳入标准：（1）年龄≥18岁；（2）符合肺炎诊断标准；（3）所有患者均签署知情同意书。排除标准：（1）心脑血管、肝、肾功能严重障碍患者；（2）患有造血功能障碍、出血性疾病、肿瘤患者；（3）2周内使用抗凝药物［4］。两组年龄、性别等一般资料比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），具有可比性。本研究经河南省职工医院医学伦理委员会审批通过。

2.方法

（1）患者入院确诊肺炎后，收集受试者清晨空腹静脉血，进行凝血功能、细胞因子检测及淋巴细胞亚群检测，并比较相关变化，包括白细胞介素（IL）-4、IL-6、IL-10、IL-1β、干扰素-γ（IFN-γ）、凝血因子活性R时间、纤维蛋白原水平K时间、纤维蛋白原水平α角、血小板功能最大振幅（maximum amplitude，MA）、CD3+、CD4+、CD4+/CD8+［5-6］；通过q-PCR检测口咽拭子，下呼吸道7项，确定肺炎感染菌株。对照组于清晨空腹收集静脉血做对照。（2）标本采集和处理。选用促凝管抽取静脉血用于机体细胞因子的检测［7］，选用枸橼酸抗凝管抽取2 ml静脉血用于血凝功能的检测，选用EDTA抗凝管用于淋巴细胞亚群的检测［8］。细胞因子检测：利用流式细胞仪测定细胞因子的变化情况，将促凝管血离心3 000 r/min，5 min，离心机半径85 mm。取50 µl上清于流式管后加入50 µl捕获微球，室温避光孵育1 h后加入100 µl荧光标记抗体，再次室温避光孵育1 h，磁分离1～2 min后加入200 µl磁珠稀释液洗涤，重复1次，加入200 µl磁珠分离液，上机检测细胞因子的数据变化；凝血功能检测：取1 ml全血予以20 µl高岭土试剂静置激活4 min，利用血栓弹力图仪观察机体血小板计数、纤维蛋白原、凝血因子等血凝指标［9］；淋巴细胞亚群检测：取30 µl的CD3+/CD4+/CD8+/CD45预混抗体分别加到T和BNK流式管中，然后加入50 µl充分混匀的抗凝全血，涡旋混匀，室温避光孵育15 min，加入450 µl的1×溶血素，涡旋混匀，避光孵育15 min，上机检测。仪器：流式细胞仪（型号：EasyCell 206A1），血栓弹力图（型号：LEPU-8800）。

3.观察指标

观察并记录受试者IL-1β、L-4、IL-6、IL-8、IL-10和IFN-γ等炎性因子的变化；观察并记录受试者的血凝情况，包括凝血因子活性R时间、纤维蛋白原水平K时间、纤维蛋白原水平α角、血小板功能MA；观察并记录CD3+、CD4+、CD4+/CD8+的变化情况，并将其数据进行对比与分析。

4.统计学方法

采用GraphPad Prim 8.0进行统计学分析，计数资料采用χ2检验，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，3组间比较采用单因素方差分析，两组间均数采用独立样本t检验，凝血功能、细胞因子、淋巴细胞亚群与肺炎严重程度的相关性采用Spearman相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.80例患者肺炎感染类型分布

由下呼吸道7项结果可知，本研究80例肺炎患者的感染种类大致分布在肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌。肺炎链球菌51例，占比63.75%，肺炎克雷伯菌24例，占比30.00%，二者同时感染患者有5例，占比6.25%。由此可见，本研究肺炎患者大多是由肺炎链球菌所致。

2.细胞因子（表1）

表1 肺炎患者与健康体检者的细胞因子对比（ng/L,±s）

表1 肺炎患者与健康体检者的细胞因子对比（ng/L,±s）

注：根据急性生理学和慢性健康状况评价Ⅱ（APACHEⅡ）评分，其中危重型及以上APACHEⅡ评分≥12分，非危重型APACHEⅡ评分＜12分；对照组为健康体检者。IFN-γ为干扰素-γ，IL为白细胞介素；与非危重组、对照组比较，aP＜0.05

组别对照组非危重组危重组F值P值例数50 44 36 IFN-γ 5.22±1.77 13.61±2.44 26.28±4.63a 4.52 0.044 IL-4 6.32±1.50 15.55±3.76 41.43±4.33a 4.99 0.019 IL-10 5.26±1.23 12.44±2.57 30.35±7.96a 4.22 0.026 IL-8 14.42±3.56 27.25±6.91 121.12±30.53a 5.37 0.031 IL-1β 7.44±2.72 14.42±2.95 30.52±3.19a 5.71 0.025 IL-6 7.16±2.23 90.55±22.67 430.47±110.23a 12.42＜0.001

在肺炎的发生发展过程中，机体可产生炎性应激反应，使部分炎性因子不同于正常水平［10］。本研究发现，肺炎严重程度与机体炎性因子水平差异有统计学意义（均P＜0.05）。危重组患者IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-8、IL-1β、IL-6指标均高于非危重组、对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。危重组IL-6水平是非危重组的6.31倍，分析原因为IL-6作为Th2型细胞因子可调节体内的免疫功能，当危重型感染患者时IL-6水平会骤然升高，因此，可通过测定细胞因子判定肺炎的严重程度［11］。当IL-4、IL-6、IL-8、IL-10因子迅速升高上百倍，甚至数千倍时，往往代表病情迅速发展，需要密切观察和治疗。同时，若IL-6、IL-10均升高10倍，可能提示革兰阴性菌感染；IL-6升高2倍以上，但IL-10增高值＜10倍，可能提示革兰阳性菌感染，因此，细胞因子测定对临床判断感染种类及感染程度具有重要的实践意义。对照组与非危重组IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-8、IL-1β、IL-6的Spearman相关系数（r=0.32、0.36、0.31、0.42、0.35、0.54）；非危重组与危重组IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-8、IL-1β、IL-6的Spearman相关系数（r=0.27、0.48、0.30、0.59、0.21、0.89）。

3.凝血功能（表2）

表2 肺炎患者与健康体检者的凝血功能对比（±s）

表2 肺炎患者与健康体检者的凝血功能对比（±s）

注：根据急性生理学和慢性健康状况评价Ⅱ（APACHEⅡ）评分，其中危重型及以上APACHEⅡ评分≥12分，非危重型APACHEⅡ评分＜12分；对照组为健康体检者。α角、K时间均代表纤维蛋白原水平，MA为最大振幅，代表血小板功能，R时间代表凝血因子活性；与非危重组、对照组比较，aP＜0.05

组别对照组非危重组危重组F值P值例数50 44 36 α角（deg）72.44±4.82 55.38±4.44 42.62±3.37a 4.31 0.039 MA（mm）71.62±3.54 51.23±3.76 39.61±2.87a 4.27 0.036 R时间（min）4.22±0.50 7.26±0.64 10.43±0.85a 13.65 0.008 K时间（min）1.28±0.41 2.12±0.29 3.92±0.31a 12.59 0.074

机体在肺炎的发生发展过程中可产生相应的炎性反应，导致凝血功能发生异常［12］。利用血栓弹力图对肺炎患者进行凝血功能监测，有助于对病情的诊断与预后。危重组患者纤维蛋白原水平α角、血小板功能MA均低于非危重组、对照组，凝血因子活性R时间、纤维蛋白原水平K时间均高于非危重组、对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。对照组与非危重组纤维蛋白原水平α角、血小板功能MA、凝血因子活性R时间、纤维蛋白原水平K时间的Spearman相关系数（r=-0.50、-0.78、0.44、0.79）；非危重组与危重组纤维蛋白原水平α角、血小板功能MA、凝血因子活性R时间、纤维蛋白原水平K时间的Spearman相关系数（r=-0.33、-0.36、0.24、0.19）。以上结果表明，肺炎从非危重型到危重型，凝血功能存在相应变化，与相关研究一致［13］。因此，实时监测凝血功能对肺炎的诊断及预后具有重要的临床意义。

4.淋巴细胞亚群（表3）

表3 肺炎患者与健康体检者的淋巴细胞亚群对比（±s）

表3 肺炎患者与健康体检者的淋巴细胞亚群对比（±s）

注：根据急性生理学和慢性健康状况评价Ⅱ（APACHEⅡ）评分，其中危重型及以上APACHEⅡ评分≥12分，非危重型APACHEⅡ评分＜12分；对照组为健康体检者。与非危重组、对照组比较，aP＜0.05

组别对照组非危重组危重组F值P值例数50 44 36 CD3+（%）78.15±4.22 62.27±3.21 48.42±3.38a 6.84 0.002 CD4+（%）42.32±1.56 37.22±2.72 29.56±1.15a 7.30 0.010 CD4+/CD8+1.85±0.13 1.46±0.20 1.15±0.16a 5.90 0.020

T淋巴细胞是评价免疫功能最重要的指标，其分子标志物为CD3+，可反映机体免疫功能状态。CD4+/CD8+比值可反映集体的免疫功能程度，比值越低免疫功能越差［14］。对照组、非危重组、危重组的CD3+、CD4+淋巴细胞亚群及CD4+/CD8+比值均呈下降趋势，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。由此可见，不同严重程度的肺炎与机体的免疫状态密切相关。危重组患者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+指标均低于非危重组、对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。对照组与非危重组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+指标的Spearman相关系数（r=-0.22、-0.10、-0.11）；非危重组与危重组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+指标的Spearman相关系数（r=-0.15、-0.19、-0.08）。

讨论

据世界卫生组织（WHO）调查显示，呼吸系统急性感染病死率中，肺炎占75%。因此，肺炎感染程度准确的判断对于临床合理用药、保障人民身体健康具有重要的临床意义。机体经病原微生物感染后可分泌炎症因子和毒素而加重感染程度，甚至引发更多的并发症，严重威胁人们的生命健康［15］。炎症因子随着血流进入血液系统可引起机体血小板功能、凝血因子活性、纤维蛋白原水平发生显著变化，导致机体凝血功能障碍。因此，肺炎患者进行细胞因子及凝血功能测定对判断患者感染严重程度具有重要意义。

在感染性疾病中，IFN-γ、IL-8、IL-1β、IL-6等促炎细胞因子可激活全身或局部的炎性反应，感染程度不同，其数值可发生较大变化［16］。本研究中，危重组IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-8、IL-1β、IL-6分别是非危重组肺炎患者的2.46、7.69、3.09、4.22、2.66、6.31倍，且均高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。这表明促炎细胞因子在重症肺炎发生发展过程中发挥重要作用，因此，可通过测定细胞因子判断机体感染程度及预后疗效。同时，危重组及非危重组肺炎患者的凝血功能显示，凝血因子活性R时间、纤维蛋白原水平K时间随着肺炎严重程度数值会升高，具有一定相关性，危重组及非危重组差异均有统计学意义（均P＜0.05）。这是由于R时间代表机体的凝血状态，K时间代表血凝块形成的速度，当患者为重症肺炎时，机体血小板和纤维蛋白原较少，形成血凝块的速度放缓，表现为低凝状态，二者数值水平与炎症程度密切相关。纤维蛋白原水平α角、血小板功能MA分别代表血凝酶形成的速度和血凝块的硬度及最大强度，危重组肺炎患者的数值均低于非危重组，二者呈负相关关系。肺炎严重程度的增加，纤维蛋白原水平α角、血小板功能MA逐渐降低，对毛细血管的保护相应降低，病死率相应增加［17-18］。

本研究采用流式细胞仪技术比较正常人及不同严重程度肺炎患者的淋巴细胞亚群变化。当肺炎较为严重时，机体免疫能力会下降，T淋巴细胞从而减少，可能会导致疾病进一步严重的现象［19］。本研究表明，随着肺炎严重程度的增加，机体的免疫功能逐渐降低，危重组CD3+T淋巴细胞与非危重组、对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。CD4+/CD8+比值与肺炎严重程度呈负相关关系，比值越低，表明肺炎越严重。因此，在疾病早期检测淋巴细胞亚群，有助于疾病的治疗及预后［20］。

由本研究可知，当机体正相关系数细胞因子、凝血因子活性R时间、纤维蛋白原水平K时间增加时，肺炎的严重程度相应增高，Spearman相关系数均r＞0；随着体内负相关系数纤维蛋白原水平α角、血小板功能MA、CD3+、CD4+的降低，肺炎的严重程度相应增高，Spearman相关系数均r＜0。因此，本研究表明细胞因子及凝血功能测定对评估肺炎感染程度及预后具有重要的临床意义，临床可广泛使用。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明李明伟：文章撰写，试验设计和统筹安排；肖慧芳：试验操作，对文章的知识性内容作批评性审阅；冯玉龙：数据分析