健脾清化方对肥胖小鼠血管内皮的保护作用研究

王琳 ，刘亚华 ，韩煦， ，金燊懿 ，陈清光， ，陆灏，

1.上海中医药大学附属曙光医院，上海 201203；2.上海中医药大学附属曙光医院糖尿病研究所，上海 201203

肥胖是由遗传和环境共同作用导致的慢性代谢性疾病，近年来已成为全球重要公共卫生问题之一。2020年我国居民营养与慢性病状况报告显示，18岁及以上成人超重/肥胖超过半数[1]。肥胖是心血管疾病（cardiovascular diseases，CVD）的危险因素，肥胖人群更易出现心脏代谢异常。近年来，过度肥胖导致的血管功能障碍引起众多研究者关注[2-3]。中医学认为，肥胖病机为“胃强脾弱”，导致痰湿、气郁、血瘀。课题组应用健脾清化方治疗肥胖型糖尿病具有减重作用，给药6周可降低肥胖小鼠体质量、脂肪含量，改善脂肪异位沉积[4]，且对代谢综合征患者血管内皮具有保护作用[5-6]，但其作用机制尚不明确。本研究以高脂饲料喂养诱导肥胖小鼠模型，观察健脾清化方对肥胖小鼠血管内皮的保护作用，并初步探讨其作用机制，为后续研究提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级雄性C57BL/6小鼠30只，6周龄，体质量（18±2）g，北京维通利华实验动物技术有限公司上海分公司提供，生产许可证号SCXK（沪）2017-0011。饲养于SPF级实验室，所有操作严格遵守上海中医药大学实验动物伦理规定，并经过伦理委员会审批（PZSHUTCM210903001）。高脂饲料，美国Research Diets公司，货号D12492。

1.2 药物及制备

健脾清化方（党参15 g，黄芪15 g，黄芩9 g，黄连3 g，黄精15 g，山药15 g，葛根15 g，鬼箭羽15 g），饮片购自上海中医药大学附属曙光医院中药房，并委托制剂科制成中药浸膏。具体方法：饮片加1 000 mL蒸馏水浸泡1 h，常规煎煮2次，每次30 min，过滤，将2次药液混合，浓缩成含原药材1.3 g/g浸膏，置于4 ℃冰箱保存。盐酸二甲双胍片，瑞士默克雪兰诺公司，0.5 g/片，批号LTABQ 2691。将药片碾碎后溶于生理盐水，制成30 mg/mL混悬液。

1.3 试剂与仪器

无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司，批号100092683），二甲苯（国药集团化学试剂有限公司，批号10023418），HE 染液套装（武汉塞维尔，批号G1003），Masson 三色染色液（武汉塞维尔，批号G1006），中性树胶（国药集团化学试剂有限公司，批号10004160），血小板内皮细胞黏附分子-1（PECAM-1/CD31）抗体（武汉塞维尔，批号GB11063-2），NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）抗体（武汉塞维尔，批号GB11300），HRP 标记山羊抗小鼠IgG（武汉塞维尔，批号GB23301），HRP 标记山羊抗兔IgG（武汉塞维尔，批号GB23303），免疫组化试剂盒DAB显色剂（丹麦DAKO，批号K5007）。

Nikon Eclipse E100 显微镜（日本尼康），Nikon DS-U3型成像系统（日本尼康），Pannoramic MIDI病理扫描仪（匈牙利3DHISTECH），Tecnai G2 spirit Bio TWIN透射电子显微镜（美国FEI），ST40台式离心机（美国Thermo），Optima L-90K 高速离心机（美国Beckman），TD6K掌上离心机（湖南湘仪）。

2 实验方法

2.1 分组、造模及给药

30只小鼠适应性喂养1周后，随机分为正常组6只和模型对照组24只，正常组予普通饲料喂养，模型对照组予高脂饲料喂养12周，以模型对照组小鼠体质量≥1.2倍正常组为造模成功[7-9]，最终成模率为75%。将成模小鼠再次随机分为模型组、健脾清化方组和盐酸二甲双胍组，每组6只。健脾清化方组予健脾清化方药液（将浸膏用生理盐水配制成1.61 g/mL溶液）20.961 g/kg灌胃，盐酸二甲双胍组予盐酸二甲双胍混悬液300 mg/kg灌胃，灌胃体积0.1 mL/10 g，模型组和正常组予等体积生理盐水灌胃，1次/d，连续6周。

2.2 取材

给药结束后，小鼠禁食12 h，3%戊巴比妥钠腹腔注射30 mg/kg麻醉，沿肋弓下缘两侧向上剪开胸腔，取胸主动脉，每只小鼠取同一部位，用于病理观察和免疫组化检测，剩余组织置于液氮中，转移至-80 ℃冰箱保存。

2.3 HE染色

取胸主动脉环切，于4%多聚甲醛中固定24 h，梯度脱水后包埋，制作石蜡切片，常规HE染色，中性树胶封片，显微镜下观察胸主动脉结构，使用病理扫描仪扫描切片并拍照。

2.4 Masson染色

制作石蜡切片后进行Masson 染色，中性树胶封片，置于显微镜下观察胸主动脉纤维化改变，使用病理扫描仪扫描切片并拍照。

2.5 透射电镜观察

取小鼠胸主动脉环切，固定于2.5%戊二醛，经漂洗、锇酸固定、再漂洗、脱水、包埋、切片及染色等处理后，观察胸主动脉内皮细胞超微结构。

2.6 免疫组化检测

石蜡切片脱蜡至水，置于EDTA抗原修复缓冲液中进行抗原修复，冷却后PBS洗涤3次，每次5 min，阻断内源性过氧化物酶，封闭，洗涤，加CD31一抗（1∶500）、NLRP3一抗（1∶800），4 ℃孵育过夜，加二抗（1∶200），室温孵育1 h，DAB显色，苏木素复染细胞核，脱水，封片。各切片随机选取5个视野，应用Image J软件计算阳性染色面积（area）及积分光密度（IOD），结果以平均光密度（IOD/area）表示。

3 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0.2统计软件作图并进行分析。计量资料以±s表示，符合正态分布且满足方差齐性，两组间比较用t检验，多组比较用方差分析；不符合正态分布或方差不齐用Kruskal-WallisH检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 健脾清化方对模型小鼠胸主动脉病理形态的影响

正常组小鼠主动脉内膜表面光滑，内皮结构完整，未见泡沫细胞，未见纤维组织增生等病变，内膜及中膜弹力膜排列整齐、呈波浪状；模型组小鼠胸主动脉局部内皮细胞脱落，内膜层增厚，有泡沫样细胞聚集，局部管壁平滑肌和弹力纤维萎缩，平滑肌细胞排列紊乱，管壁明显变薄；健脾清化方组和盐酸二甲双胍组小鼠胸主动脉内皮结构基本完整，内膜层无增厚，内皮细胞脱落较少，中膜平滑肌细胞排列紊乱及萎缩情况有一定改善，且弹力膜排列较模型组整齐。见图1。

图1 各组小鼠胸主动脉形态（HE染色，标尺=50 μm）

4.2 健脾清化方对模型小鼠胸主动脉纤维化的影响

Masson染色胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色。正常组小鼠胸主动脉内膜及中膜弹力膜呈波浪状排列，内膜胶原纤维含量极少；模型组小鼠胸主动脉内膜较正常组增厚，内膜下胶原纤维明显增加，弹力膜排列紊乱；与模型组比较，健脾清化方组和盐酸二甲双胍组小鼠胸主动脉内膜及中膜胶原纤维有一定减少，且弹力膜排列整齐。见图2。

图2 各组小鼠胸主动脉形态（Masson染色，标尺=50 μm）

4.3 健脾清化方对模型小鼠胸主动脉内皮细胞超微结构的影响

正常组小鼠胸主动脉内皮细胞形态规则，基膜完整，细胞核形态基本正常，内弹力膜厚度均匀；模型组小鼠胸主动脉内皮细胞形态不规则，细胞肿胀，基膜不连续，内皮下间隙增大，部分异染色质有边集现象，细胞核减小且有轻度固缩，部分胞体突向管腔，内弹力膜密度不均匀；健脾清化方组小鼠胸主动脉内皮细胞形态基本规则，细胞无明显肿胀，基膜部分不连续，内皮下间隙增大，染色质分布较模型组好转，细胞核形态基本正常，内弹力膜密度基本一致；盐酸二甲双胍组小鼠胸主动脉内皮细胞完整，形态基本规则，内皮下细胞间隙增大，细胞核形态基本正常，内弹力膜厚度较均匀。见图3。

图3 各组小鼠胸主动脉内皮细胞超微结构

4.4 健脾清化方对模型小鼠胸主动脉组织CD31 蛋白表达的影响

CD31为血管内皮细胞标志物，免疫组化染色表现为黄色或棕黄色。正常组小鼠胸主动脉内膜有大量棕黄色颗粒沉积，CD31呈强阳性表达；模型组小鼠胸主动脉内膜CD31表达降低，部分未见CD31表达，提示血管内皮细胞有脱落和损伤；健脾清化方组和盐酸二甲双胍组小鼠胸主动脉内膜CD31蛋白表达更接近正常组。见图4。

图4 各组小鼠胸主动脉组织CD31蛋白表达（免疫组化染色，×400）

4.5 健脾清化方对模型小鼠胸主动脉组织NLRP3蛋白表达的影响

正常组小鼠胸主动脉组织几乎不表达NLRP3；与正常组比较，模型组小鼠胸主动脉组织NLRP3棕黄色颗粒沉积明显增加（P＜0.01），主要分布在胸主动脉平滑肌细胞胞质中；与模型组比较，健脾清化方组和盐酸二甲双胍组小鼠胸主动脉组织NLRP3 表达显著降低（P＜0.01）。见图5、图6。

图5 各组小鼠胸主动脉组织NLRP3蛋白表达（免疫组化染色，×400）

图6 各组小鼠胸主动脉组织NLRP3表达比较（±s，每组4只）

5 讨论

肥胖是糖尿病和CVD的主要危险因素，血管内皮是血液与血管壁之间的重要屏障，内皮功能受损发生在肥胖的最早阶段，是导致CVD血管改变的基础[10]。大量证据表明，肥胖伴随血管内皮功能障碍和血管密度降低[11-12]。研究还发现，肥胖可以使嗜中性粒细胞重编程，从而破坏血管内皮细胞黏附，增加血管通透性，促进癌细胞扩散[13]。作为与血液直接接触的细胞，血管内皮细胞在感知及调控机体代谢变化过程中起重要作用。最新研究发现，内皮细胞和脂肪细胞的相互作用是维持白色脂肪组织稳态的基础，而血管内皮细胞分泌代谢信号对白色脂肪组织稳态和机体代谢非常重要[14]。因此，修复血管内皮结构与功能对治疗肥胖及其引起的继发性疾病有重要意义。

中医药治疗肥胖在控制体质量、减少反弹等方面具有一定优势。对于肥胖引起的血管内皮损伤，中医学认为其病位在脉，脉功能正常是保证血液循行正常的重要条件。朱丹溪提出“痰挟瘀血，遂成窠囊”之说，以气病日久成痰化瘀阐明痰浊与瘀血相互胶结，附于脉络，破坏血管内环境稳态而共同为患的病机，益气活血或活血化瘀中药具有保护血管内皮功能的作用[15]。健脾清化方是蔡淦教授在李东垣“阴火”概念指导下，结合临床经验制定的基础方。方中党参、黄芪为君药，可大补中气；黄连、黄芩清泄阴火，山药、黄精补脾益阴，共为臣药；葛根升提阳气、升清止渴，鬼箭羽清郁久深入血分之邪热，活血化瘀，为佐使。全方可益气养阴、活血化瘀。课题组前期研究表明，健脾清化方具有减重、调脂作用[4]。本实验发现，健脾清化方能改善高脂饮食诱导的肥胖小鼠受损的血管内皮结构和炎症状态，体现在恢复主动脉内皮结构完整性、减少内皮细胞脱落、减轻血管内皮细胞肿胀、缩小内皮细胞间隙等。

肥胖者血管内皮稳态受损与缺氧、炎症、氧化应激和免疫失衡等因素相关[16]。CD31在循环的血小板和白细胞中主要作为抑制受体，通过调节其细胞质域的连续磷酸化，限制细胞激活反应。同时也在血管内皮细胞之间的连接处高表达，因此，可作为血管内皮细胞的特异性标记物[17-18]。CD31参与维持血管内皮细胞结构完整性，同时作为黏附性应激反应蛋白，在炎症或血栓形成后加速血管通透性屏障的恢复，可能是治疗血管通透性障碍的靶点[19]。临床前研究认为，CD31激动剂对动脉粥样硬化患者具有一定治疗潜力，或可作为动脉粥样硬化的治疗靶点[20]。CD31免疫组化染色主要定位在血管内皮细胞胞浆及血管内皮细胞之间的连接处。因血管内皮细胞是长梭形单层细胞，染色结果呈一条线，目前文献中缺乏较好的定量评价方法，因此本研究未做定量分析。本研究发现，正常组小鼠胸主动脉内膜CD31呈强阳性表达，而模型组小鼠胸主动脉内膜CD31表达明显降低，提示血管内皮细胞脱落和损伤。而健脾清化方和盐酸二甲双胍干预后，模型小鼠血管内皮细胞CD31表达有所升高，说明健脾清化方对血管内皮细胞有一定保护作用。

炎症因子有助于全身性低度炎症的发展，异常的NLRP3激活可驱动体内慢性炎症状态，从而调节炎症相关疾病进程[21]。多种内外因子均可激活NLRP3[22]，适度调节NLRP3活性对维持细胞稳态至关重要。研究发现，肥胖患者皮下脂肪组织和内脏脂肪组织中NLRP3 表达上调[23]。NLRP3 可感知肥胖相关危险信号，并参与肥胖诱导的炎症和胰岛素抵抗[24]。临床研究发现，NLRP3在冠状动脉粥样硬化患者主动脉中高表达，且与冠状动脉病变严重程度及动脉粥样硬化危险因素相关[25-27]。本研究中模型组小鼠胸主动脉组织NLRP3表达较正常组升高，而健脾清化方和盐酸二甲双胍可降低模型小鼠NLRP3表达，说明健脾清化方可以通过下调NLRP3表达减轻肥胖小鼠血管炎症。

综上所述，健脾清化方能在一定程度上改善肥胖小鼠受损的内皮细胞结构，改善内皮细胞功能，抑制炎症状态，这种作用可能是通过抑制NLRP3表达实现的，同时对于重要靶点CD31具有靶向作用。后续将以NLRP3上下游通路联合CD31的调控机制作为研究切入点，深入探索健脾清化方保护肥胖小鼠血管内皮细胞的机制，为健脾清化方的临床应用提供参考。