动物源性食品中酰胺醇类兽药残留检测的样品前处理技术研究进展

汪海珍,许红霞,李 朔,潘源虎,陈冬梅

(华中农业大学动物医学院,国家兽药残留基准实验室(HZAU),武汉 430070)

酰胺醇类药物(Chloramphenicols,CAPs)是一类高效广谱抗生素药物,包括:氯霉素(Chloramphenicol,CAP)、甲砜霉素(Thiamphenicol,TAP)、氟苯尼考(Florfenicol,FF)、氟苯尼考胺(Florfenicol amine,FFa)、琥珀氯霉素、棕榈氯霉素等。酰胺醇家族中最古老的成员是CAP,因其抗菌效果好,价格低廉,被广泛用于动物细菌疾病的预防,但CAP存在严重的毒副作用。美国、欧盟以及包括中国在内的许多国家和地区均规定动物性食品中不得检出CAP。因此,TAP和FF被相继开发出来作为CAP的替代品,主要用于治疗牛、猪和家禽的呼吸道和消化道传染病。近年来,该类药物的大量以及不合理使用,造成在动物性食品中的一定程度的残留,对人体健康造成了严重威胁。因此,为了预防和控制动物性食品中的污染,加强对酰胺醇类药物检测方法的研究具有重要意义。样品前处理技术是动物性食品中兽药残留分析的关键环节,直接影响检测的效率和准确度。本文对近几年应用于动物性食品中酰胺醇类兽药残留的样品前处理技术进行综述,以期为动物性食品中酰胺醇类兽药残留检测提供依据。

1 常见的样品前处理技术

1.1 液液萃取(Liquid-liquid extraction,LLE) LLE利用同一物质在两种不相溶的溶剂中溶解度不同,从而达到分离、提取或纯化的目的。在动物源性食品的CAPs检测分析中,乙酸乙酯和乙腈是应用最多的提取溶剂。通常单独或者作为混合物用于酰胺醇类药物提取[1-2]。但液液萃取方法存在萃取剂使用量较大、同时易产生乳化现象等问题,因此出现了新型的液相萃取技术。

离子液体-盐水双相体系通常是由一种有机盐(亲水性离子液体)、一种无机盐(如磷酸盐、碳酸盐、氢氧化物等)和水相组成,它综合了离子液体和双水相体系的优点。Yao等[3]报道了用聚氧乙烯十二烷基醚-盐水双相萃取系统提取鸡蛋、牛奶和蜂蜜中的TAP,该方法的回收率可达99.59%。Sichilongo等[4]用THF-水溶液提取牛肌肉组织中CAP、TAP和FF,THF-水溶液具有比乙腈-水溶液和甲醇-水溶液更高的提取效率。

1.2 分散液液微萃取(Dispersive liquid-liquid microextraction,DLLME) DLLME是基于样品溶液、萃取剂(与水互不相溶)和分散剂(与水相和萃取剂混溶)组成的三重溶液系统开发的一种新型液相微萃取技术。与LLE相比,其基本原理相似,但实现了液液萃取的微型化,减少了有机溶剂的使用。DLLME方法具有操作简便、快速、富集效率高、萃取剂使用量少、环境友好型等优点。

DLLME与其他提取净化方法结合,用于提取样品中的CAP,能够提高萃取效率。Campone等[5]采用超声辅助DLLME提取蜂蜜中的CAP,超高效液相色谱-串联质谱(Ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)测定。三氯甲烷为萃取剂,乙腈为分散剂,用10%NaCl提高离子强度。该方法的回收率为54%～60%,相对标准偏差(Relative standard deviation,RSD)小于5%,检测限(Limit of detection,CCα)和定量限(Limit of quantification,CCβ)分别为0.0115 μg/kg和0.0364 μg/kg。Amelin等[6]结合DLLME和QuEChERS方法同时提取净化食品中CAP和TAP。样品用乙腈-甲酸提取,加入无水MgSO4和NaCl等无机盐,离心后移取上清液,用PSA和C18净化,二氯甲烷为萃取剂进行DLLME萃取。方法回收率为64%～87%,RSD小于9%。

1.3 加速溶剂萃取(Accelerated solvent extraction,ASE) 加速溶剂萃取方法是采用常规溶剂,在较高温度下用溶剂对固体或半固体样品进行萃取的样品前处理技术。ASE的基本原理是利用升高温度和压力,增加物质溶解度和溶质扩散速度,提高萃取效率。与传统的提取方式相比,ASE具有萃取快速、萃取溶剂用量少、样品回收率高,提取过程自动化等特点。Wu等[7]建立了ASE萃取结合液相色谱-质谱联用(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)检测家禽羽毛中TAP、CAP、FF残留分析方法。该方法的回收率60.4%～107.6%之间。检测限(Limit of detection,LOD)为0.2～3.0 μg/kg,定量限(Limit of quantification,LOQ)为0.5～8.3 μg/kg。王波等[8-9]采用ASE方法萃取鹌鹑蛋和鸽蛋中CAP、TAP、FF以及FFa。该实验将样品置于硅藻土研磨后,装入萃取池,萃取溶剂为甲醇:氨水:水溶液(97∶2∶1,V/V/V),萃取温度为80 ℃,压力为1.034×104kPa,静态萃取时间5 min。方法LOD为0.04～0.5 μg/kg,LOQ为0.08～1.5 μg/kg,平均回收率为90.26%～105.73%,RSD均低于3.29%。Wang等[10]用ASE法提取禽蛋中TAP、FF和FFa,用乙腈-氨水(98∶2,V/V)萃取样品,用乙腈饱和正己烷脱脂。LOD和LOQ分别为1.8～4.9 μg/kg和4.3～11.7 μg/kg,回收率均在80.1%以上。

1.4 亚临界水萃取(Subcritical water extraction,SWE) 亚临界水萃取是一种环保的萃取技术,也称为加压热水萃取(Pressurized hot water extraction,PHWE)。SWE是一种从固体和半固体样品中定量萃取极性和非极性化学物质的方法。SWE基于在100 ℃和374 ℃(水的临界点,374 ℃和22 MPa)之间的温度下使用水作为萃取溶剂,并且在足够高的压力下使其保持液态。

Xiao等[11]利用亚临界水萃取家禽组织中的CAP、TAP、FF和FFa。将样品加入硅藻土混合研磨后,装入不锈钢萃取池中。萃取流程如下:0.2%氢氧化铵水溶液作为萃取溶剂,萃取温度为150 ℃,压力为100 bar,萃取时间为3 min,两个静态循环。萃取完成后,用UPLC-MS/MS检测。平均回收率为86.8%～101.5%,RSD低于7.7%;LOD为0.03～0.5 μg/kg,LOQ为0.1～2.0 μg/kg。徐万邦等[12]基于SWE,开发了一种用于测定动物源性食品中氯霉素、土霉素和四环素的快速分析方法。方法的回收率在92.1%～104.8%之间,RSD值在0.3%～0.5%之间。

1.5 固相萃取(Solid-phase extraction,SPE) 与LLE相比,SPE具有不需要使用大量有机溶剂,处理过程中不会出现乳化现象,样品处理简单,耗时短等特点。SPE中关键步骤是固相萃取吸附剂的选择,吸附剂可以影响选择性、亲和性以及容量。目前,用于CAPs残留分析的SPE柱填料种类较多,主要有C18、HLB、MCX、Chem Elut、Florisil和硅胶等,目前常用的萃取柱见表1。

表1 酰胺醇类药物常用的固相萃取柱Tab 1 Solid phase extraction columns commonly used for amphenicols drugs

1.6 基质固相分散萃取(Matrix solid-phase dispersion,MSPD) MSPD是将涂有C18等多种聚合物的固相萃取材料与样品一起研磨,制得半干状态的混合物并将其作为填料装柱,然后采用类似SPE的方法,用不同的溶剂淋洗萃取柱,将各种待测物洗脱。MSPD是在SPE基础上改进后的处理方法,与SPE比较,其优点在于:浓缩了传统样品前处理过程中的提取和净化过程,操作简单。

Pan等[22]建立了基于MSPD的UPLC-MS/MS方法测定鱼肉中的CAP、TAP和FF的含量。肌肉组织与C18分散剂混合研磨,制成固相萃取柱,用乙腈-水(50:50,V/V)洗脱。CAP、TAP和FF的CCα和CCβ范围分别为0.02～0.06 μg/kg和0.11～0.16 μg/kg,平均回收率为84.2%～99.8%,RSD低于16.6%。Tao等[23]建立了测定虾和鱼中CAP、TAP、FF和FFa的LC-MS/MS(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)方法。样品采用MSPD萃取净化,将样品与C18填料混合装入MSPD柱。方法的CCα和CCβ分别为0.01～0.09 μg/kg和0.04～0.25 μg/kg,回收率为83.8%～98.8%,RSD低于13.7%。

1.7 磁性固相萃取法(Magnetic solid-phase extraction,MSPE) 磁性固相萃取技术是以磁性或可磁化的材料作为吸附剂的一种分散固相萃取技术。在MSPE过程中,磁性吸附剂不直接填充到吸附柱中,而是被添加到样品的溶液或者悬浮液中,将目标分析物吸附到分散的磁性吸附剂表面,在外部磁场作用下,目标分析物随吸附剂一起迁移,最终通过合适的溶剂洗脱被测物质,从而与样品的基质分离开来。相较常规DSPE填料相比,纳米颗粒的比表面积大,扩散距离短,具有非常高的萃取能力和萃取效率。Vuran等[24]使用MSPE方法提取并净化牛奶样品中的CAP,高效液相色谱-二级线性阵列检测器法(High-performance liquid chromatography-diode array detector,HPLC-DAD)检测。作者首先合成了磁性碳纳米纤维,将其作为吸附剂用于吸附CAP。样品用缓冲液提取,离心后,提取液中加入制备好的磁性碳纳米纤维吸附CAP,用ACN:MeOH(1∶1,V/V)洗脱。方法的LOD为3.02 μg/L,回收率为94.6%～105.4%,RSD低于4.0%。Zhang等[25]制备了一种新型的适配体修饰的磁性介孔碳,用于MSPE方法净化鱼和鸡肉样品中CAP。方法LOD为0.94 pmol/L,回收率为87.0%～107%,RSD为3.1%～9.7%。Huang等[26]合成了一种新型核酸适配体功能化磁性吸附剂,用于选择性富集食品中的CAP、TAP和FF。首先采用溶胶-凝胶法合成磁性二氧化硅包覆的Fe3O4微球(Fe3O4@SiO2),然后加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-Aminopropyltriethoxysilane,APTES)试剂形成Fe3O4@SiO2-NH2,再与琥珀酸酐反应形成Fe3O4@SiO2-COOH,最后加入EDC/磺基-NHS偶联剂,合成了一种非常稳定的吸附剂,用于检测CAP、TAP和FF。该吸附剂基于适配体对分析物的高亲和力,可以特异性地同时识别并富集一些复杂食品基质中的CAP、TAP和FF。

1.8 QuEChERS方法 QuEChERS(Quick,easy,cheap,effective,rugged and safe)具有快速、简便、价廉、高效、耐用和安全等优点。近年来在动物源性食品中兽药等残留检测领域应用广泛。Mou[27]采用QuEChERS方法提取禽肉和牛肉中CAP。样品用水∶乙腈(1∶1,V/V)提取,MgSO4、PSA和C18吸附剂净化,UPLC-MS/MS的分析方法测定。LOD和LOQ分别为0.16 μg/kg和0.50 μg/kg,回收率为99%～111%,RSD为0.48%～12.48%。赵浩军等[28]采用QuEChERS方法提取猪肌肉中CAP和FF。以乙腈为提取溶剂,正己烷除脂,C18吸附剂净化,LC-MS/MS测定。方法LOD为0.1 μg/kg,回收率为81.1%～115.8%,RSD为4.2%～11.8%。Jung等[29]利用LC-MS/MS同时检测牛肉、猪肉、鸡肉、虾、鳗鱼和比目鱼中的CAP、TAP、FF和FFa。通过QuEChERS萃取方法进行萃取,PSA和MgSO4进行样品净化。回收率为64.26%～116.51%,LOQ为0.02～10.4 μg/kg。

1.9 分子印迹技术(Molecular imprinting technology,MIT) MIT是将要分离的目标分子与功能单体通过共价或非共价作用进行预组装,与交联剂共聚物制备得到聚合物。分子印迹聚合物(Molecularly imprinted polymer,MIP)制备简单,能够反复使用,机械强度高,稳定性好。因此,非常适合用于SPE的填充剂或SPME的涂层填料或DSPE的吸附剂来分离复杂样品中的分析物。Samanidou等[30]以CAP为模板分子,3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)和三乙氧基苯基硅烷(Triethoxyphenyl silane,TEPS)为功能前体,原硅酸四甲酯(Tetramethyl orthosilicate,TMOS)为交联剂,异丙醇为溶剂/致孔剂,盐酸作为溶胶-凝胶催化剂,合成印迹溶胶-凝胶二氧化硅基无机聚合物吸附剂(溶胶-凝胶MIP)。合成的MIP作为萃取牛奶中CAP分子印迹固相萃取(Molecularly imprinted solid-phase extraction,MISPE)的吸附剂,LC-MS检测。方法RSD小于13%,回收率为85%～106%。Jia等[31]以CAP作为模板,甲基丙烯酸为功能单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯(Ethylene glycol dimethacrylate,EGDMA)为交联剂和偶氮二异丁腈(Azobisisobutyronitrile,AIBN)为引发剂,甲醇-乙酸(8:2,V/V)为溶剂/致孔剂,合成了MIP(CAP-MIP),用于检测鸡肉、猪肉和鱼肉中的CAP。方法的LOD为5.0 pg/g,回收率为71.5%～94.4%。Li等[32]建立了一种以磁性分子印迹聚合物(Magnetic molecularly imprinted polymer,MMIPs)为SPE吸附剂,选择性地提取食品中CAP的分析方法。由修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒为支撑材料,CAP为模板分子,甲基丙烯酸/或丙烯酰胺为功能单体,EGDMA为交联剂,AIBN为引发剂,制备了MMIPs。方法LOD为10 μg/L,回收率为95.31%～106.89%。该方法的优点在于选择性强、灵敏度高、可重复利用等,但该方法仅限于单一化合物的检测,不适于同时检测基质中多种化合物。

1.10 织物相吸附萃取(Fabric phase sorptive extraction,FPSE) 织物相吸附萃取(FPSE)是一种新一代绿色微萃取技术,通过溶胶-凝胶法将吸附剂化学键合在具有大量活性基团的织物基材表面,可显著提高涂层的热稳定性、化学稳定性和溶剂稳定性。FPSE是一种高效、简单、快速、绿色的微萃取技术。Samanidou等[33]利用FPSE提取净化原料奶中的TAP、FF和CAP。使用短链聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)创建了一种高极性聚合物涂层FPSE介质。TAP、FF和CAP回收率分别为44%、66.4%和81.4%。Chu等[34]开发出一种基于填充纳米纤维固相萃取(Solid phase extraction of filled nanofibers,PFSPE)方法,用于测定牛奶中的CAP。采用静电纺丝法制备了聚苯乙烯-聚乙烯吡咯烷酮(Polystyrene polyethylene pyrrolidone,PS-PVP)复合纳米纤维。方法回收率为97.5%～104.0%,LOD为0.2 μg/L。

综上所述,LLE、ATPS、DLLME、SWE、ASE、SPE、MSPD等是国内外动物性食品中酰胺醇类兽药残留常见样品前处理技术,它们具体的优缺点见表2。

表2 动物性食品中酰胺醇类兽药残留10种常见样品前处理技术优缺点比较Tab 2 Comparison of the advantages and disadvantages of 10 common sample pre-treatment techniques for amphenicols drugs residues in animal food

2 展 望

酰胺醇类药物被广泛地应用于畜禽以及水生动物疾病的预防、治疗等其他方面,对畜牧业的发展起到重要的作用,但不合理的使用易造成动物源性食品中兽药的残留。此外,一定比例的药物以母体药物或代谢物的形式通过粪便和尿液的排出进入环境中,对环境以及人类健康造成严重威胁。现如今,虽然色谱、质谱分离检测技术得到了很大的改善,但高效的样品前处理技术对于分析的准确度、目标化合物的响应以及前处理时间的长短影响很大。优秀的样品前处理方法能节约分析时间、最大程度去除基质干扰并使分析结果更加准确,从而获得可靠的检测数据。目前,对于动物性食品中酰胺醇类药物及其代谢物的样品前处理技术有ATPS、DLLME、SWE、ASE、SPE、MSPD、MSPE、QuEChERS、MIT、FPSE等方法,已经逐步取代传统的样品前处理法。酰胺醇类药物及其代谢物的样品前处理技术逐渐向自动化、更少的溶剂使用量、更高的样品分析通量以及更适合于复杂基质的方向发展。