醒脑灌肠液对心搏骤停心肺复苏后大鼠海马区Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响

叶倩雅 李华 周生花 任冬冬 李宗尚 郭燕可

(1河南中医药大学第二临床医学院,河南 郑州 450002;2河南省中医院(河南中医药大学第二附属医院))

心搏骤停(CA)是全球范围内高致死率的疾病之一〔1〕。据美国2020年CA统计数据显示,院外CA(OHCA)发生率每年占总人口的0.04%～0.13%,经积极心肺复苏(CPR)后自主循环恢复(ROSC)而入院的患者中,只有10.4%的患者可存活至出院,脑功能恢复良好的仅占8.2%〔2〕。CPR虽然是有效的救治手段,但仍面临脑功能恢复不全的难题。目前,针对该问题的西药疗效参差,仅亚低温治疗有一定效果,然而尚未出现成熟治疗方案。临床上中医用于神经保护的药物疗效较为确切,其中醒脑灌肠液作用明显〔3〕。研究表明,醒脑灌肠液的抗炎作用显著,大多仅着眼于脑局部缺血、缺氧等相关的疾病模型研究,如脑出血模型等〔4〕,而关于醒脑灌肠液能否通过调节凋亡通路蛋白起全脑保护作用的机制尚未见报道。本研究建立CA/CPR后大鼠全脑神经元损伤模型,探索醒脑灌肠液对于调节凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3的影响。

1 材料与方法

1.1试验药物 实验大鼠用醒脑灌肠液,处方为大黄15 g、水蛭10 g、石菖蒲12 g、冰片2 g,每剂含药量39 g,购于河南中医药大学第二临床医院中药房。将醒脑灌肠液方剂药物中的大黄、水蛭、石菖蒲按照比例加 15 倍量水煎煮两次,每次1 h,滤过后药液合并,减压浓缩。将冰片细研磨,过筛,筛孔尺寸小于1 mm,加至前述药液,融化后冷藏,使用时水浴加热至 25 ℃。安宫牛黄丸:去除塑料球壳,加适量蒸馏水恒温100 ℃水浴加热,搅拌融化,冷藏备用。安宫牛黄丸(生产批号:20017004)购于北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂。以上药液按照等效剂量换算并浓缩成 1 g/ml 的浓缩液。

1.2动物 SD雄性大鼠24只,SPF级,体质量(260.0±37.7)g,购于郑州华兴实验动物基地,饲养于河南省中医药大学第二附属医院中心实验室,温度维持在24～26 ℃,湿度为30%～40%,饲养条件为大鼠独立通气笼具(IVC),无菌饲料和垫料喂养,去离子水供应,以上由管理员雷震老师负责管理。经实验动物伦理审查通过批准后进行实验(审批号:PZ-HNSZYY-2020-018)。

1.3试剂 Bcl-2、Bax、Caspase-3抗体(中国成都,正能生物公司,批号250198、380709、381337);GAPDH 抗体(武汉三鹰生物技术有限公司,批号:00077958、1008047);二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司,批号:112720201223);聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美国Millipore公司,批号:IPVH0010);十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶试剂盒(中晖赫彩生物公司,批号:BAO223)。

1.4设备 包埋机(武汉俊杰电子有限公司,JB-P5);病理切片机(上海徕卡仪器有限公司,RM2016);脱色摇床(江苏新康医疗器械有限公司,XK-8);光学显微镜(日本尼康,NK20);SDS-PAGE凝胶电泳系统(型号:Mini-PROTEAN)、蛋白湿转仪(型号:Mini Trans-Blot)、WB成像系统(美国伯乐公司,型号:ChemiDoc XRS+)。

1.5方法

1.5.1实验模型及分组 遵循Utstein〔5〕模式CPR造模方法,使用窒息法建立大鼠模型。制造模型前禁食8 h,正常饮水。大鼠仰卧位固定于手术台上,戊巴比妥钠1 ml/kg 进行麻醉。14 G自制动脉套管行气管插管。连接生物信号采集处理系统实时监测心电Ⅱ导联,确保心电图和心率(HR)在基线水平,观察大鼠HR为300～500次/min〔6〕的纳入实验,若不满足基线条件则排除实验。体征稳定15 min后,消毒备皮,分离出左股动脉连接压力换能器,通过压力传感系统记录大鼠动脉血压(MAP)变化,血压在80～155 mmHg〔7〕者纳入实验,否则排除;右股静脉连接24G动脉留置针备用,用于抢救时给药。颈部皮肤沿正中线切开,钝性分离出0.5～1.0 cm长气管,注意分离出气管旁迷走神经以防影响HR。气管插管端连通小动物呼吸机,通气氧浓度21%,潮气量4 ml/kg,频率为100次/min。保持大鼠平稳状态5 min后,关停小动物呼吸机并用动脉夹夹闭气管,观察MAP和HR,判断CA标准〔8～10〕为:MAP≤20 mmHg;心电图出现无脉电活动、机械分离和(或)室颤波或心电活动停止表现。CA 3 min后松开夹闭气管的动脉夹,进行常规抢救措施,呼吸机打开行机械通气,同时进行胸外心脏按压,要求频率≥200次/min,按压深度达到大鼠胸廓前后径的1/3以上。同时经留置针给予肾上腺素0.02 mg/kg及电除颤或利多卡因1.5 mg/kg除颤等进行常规急救治疗。在大鼠ROSC后(即HR≥170次/min且MAP≥60 mmHg)并且能持续 5 min,则认为已复苏成功,终止按压。胸外按压超过10 min未发生ROSC者,认为复苏失败,终止CPR。为制备模型共准备大鼠37只,基线均符合标准,死亡19只,成功18只,建立CPR模型,可达到ROSC的成功率为48.64%,各组大鼠若出现死亡则从同批次大鼠选择并随机补充。造模成功后,随机分为模型(CPR)组、醒脑灌肠液(XNGC)组、安宫牛黄丸(AGNH)组各6只。另随机取6只大鼠为假手术(Sham)组。各组大鼠生命体征稳定后20 min,Sham组和CPR组给予常规西医急救治疗并予生理盐水灌肠,其余组除常规治疗外,按照相应等效剂量为XNGC和AGNH两组大鼠给药。

1.5.2实验给药和取材 CPR组、XNGC组和AGNH组均进行CPR模型制备,而Sham组不进行气管夹闭、CPR操作,余处理同前3组。实验大鼠用醒脑灌肠液,等效折算系数为0.018,故XNGC组给药3.60 g/kg。安宫牛黄丸患者使用剂量为3 g,因此AGNH组大鼠等效给药0.27 g/kg。在ROSC后0、24、48 h分别给药,Sham组和CPR组给予生理盐水灌肠,XNGC组和AGNH组分别根据大鼠体质量换算给药剂量并进行灌肠给药。将ROSC模型成功时记为0 h,在72 h时对大鼠进行空气栓塞处死,并断头取脑,分别置于液氮和4%多聚甲醛中备用于后续实验。

1.5.3神经功能缺陷评分(NDS)〔11〕在CPR后2、24、48 h时分别对大鼠进行NDS,评分范围为0%～100%,正常大鼠NDS为0%,脑死亡大鼠NDS为100%。从5个不同维度进行神经功能评价:意识和呼吸、脑神经功能、运动功能、感觉功能和平衡协调功能(包括平衡木行走)等。

1.5.4病理切片染色 取大鼠脑组织,并将组织浸泡于4%多聚甲醛常温下固定24 h以上,组织包埋石蜡修块后,以5 μm连续切片,固定在载玻片后用梯度浓度的乙醇脱水,入苏木素染液染8～10 min,用分化液分化、返蓝液返蓝,梯度酒精脱水后,伊红染液中复染8～10 min。最后,将切片脱水封片并在显微镜下观察拍照。

本研究在文献查阅与问卷调查的基础上，发现问题，提出研究构思，然后根据文献查阅及问卷分析，对小学生数学基本活动经验积累策略进行研究。除了采用文献法，主要有以下几种方法。

1.5.5免疫组化(IHC) 取大鼠脑组织,并浸泡于4%多聚甲醛常温下固定24 h以上,常规包埋修块后,以5 μm连续切片后进行脱蜡水化,高温煮沸进行抗原修复,加入一抗(Bcl-2为1∶200;Bax为1∶200;Caspase-3为1∶500,均为中国,正能生物公司提供)50 μl,4 ℃冰箱孵育过夜,滴加生物素标记的羊抗兔/鼠IgG 50 μl,室温放置15 min,加链霉亲和素-过氧化物酶溶液,同条件孵育15 min,二氨基联苯胺(DAB)-H2O2显色、苏木素复染细胞核后脱水固定。显微镜下观察,并用平均光密度值(IOD/Area)累计各切片阳性区域细胞表达百分比,并进行组间统计学对比。

1.5.6Western印迹 取大鼠脑组织分离出海马区并马上置于液氮保存,取材后放置-80 ℃冰箱冻存。取海马区的脑组织各300 mg,加入钢珠和裂解液(每300 mg加300 μl裂解液)后置于电动匀浆机快速匀浆,常规冰下裂解组织,提取蛋白,并用BCA法进行蛋白定量。取12%的SDS-PAGE处理10 μg蛋白,湿转至PVDF膜上,5%脱脂奶粉封闭1 h,加一抗(Bcl-2为1∶500;Bax为1∶1 000;Caspase-3为1∶1 000;均为中国,正能生物公司提供)4 ℃过夜。TBST洗涤3次,10 min/次,膜上加二抗(兔/鼠抗鼠,1∶2 000稀释),电化学发光(ECL)显色液曝光后凝胶成像仪显影。实验重复3次。Image Lab软件分析并计算相对灰度值进行半定量,对比结果。

1.6统计学方法 采用SPSS22.0和GraphPad Prism8.0软件进行One-way ANOVA分析、LSD-t检验、Kruskal-WallisH检验、Log-rank法χ2检验。

2 结 果

2.1各组基线情况比较 各组血压、HR、体质量和呼吸频率情况差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 各组基线资料及CA CPR模型情况对比

2.2各组CA CPR模型情况比较 CPR组、XNGC组和AGNH组CA时长、CPR时长、肾上腺素用量差异无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

2.3各组NDS比较 与Sham组比较,CPR、XNGC、AGNH组2、24、48 h NDS明显增加(P<0.01);ROSC后2 h时,CPR、XNGC和AGNH组NDS差异无统计学意义(P>0.05)。24 h时,XNGC组、AGNH组与CPR组比较差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05);48 h时,XNGC组、AGNH组与CPR组比较,均有统计学差异(P<0.01)。见表2。

表2 各组CPR后2、24、48 h NDS比较

2.4各组病理形态观察 与Sham组相比,CPR组海马区细胞明显核固缩碎裂,且细胞排列紊乱,有较多细胞水肿和胞质空泡状。与CPR组相比,XNGC和AGNH组海马区细胞排列较整齐,且胞质空泡状减少,核固缩碎裂情况有所改善,细胞水肿少见。见图1。

图1 各组海马神经元病理形态学(HE染色,×400)

图2 各组海马神经元Bcl-2、Bax、Caspase-3阳性细胞表达(免疫组化染色,×400)

表3 各组Bcl-2、Bax和Caspase-3阳性细胞平均光密度比值

2.6各组CPR后海马神经元Bcl-2、Bax、Caspase-3、蛋白表达 与Sham组相比,CPR组海马区细胞Bcl-2蛋白表达明显下调,Bax、Caspase-3蛋白表达明显上调(均P<0.01)。与CPR组相比,XNGC和AGNH组Bcl-2蛋白表达明显上调(P<0.05),Bax、Caspase-3蛋白表达明显下调(P<0.01,P<0.05)。见表4、图3。

图3 Western印迹检测各组CPR后海马神经元Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达

表4 各组Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达相对灰度值

2.7各组存活率 Sham组存活率为100.0%。与CPR组(33.3%)相比,XNGC组和AGNH组48 h内存活率(83.3%、83.3%)差异具有统计学意义(χ2=6.695,P=0.035)。

3 讨 论

醒脑灌肠液为中药复方,由大黄、水蛭、石菖蒲、冰片组成,临床应用此方已21年余。大黄扶正攻下,消瘀清热,明朝时期《本草纲目》记载用于瘟疫阳狂、斑黄谵语〔12〕,现今也用于急危重病〔13〕。石菖蒲具有通腑祛痰、开窍醒神之效〔14〕;水蛭破血通经、活血化瘀;冰片开窍清热、逐瘀醒脑。四药合用,则能发挥该方剂的神经保护作用〔15〕。现代药理学研究表明,本方对脑局部缺血、出血疾病的研究较为成熟。其中大黄通过调节磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和核转录因子(NF)-κB通路可以抗凋亡〔16〕等;石菖蒲提取成分能够通过抑制TNF-α/NF-κB信号进而抑制凋亡〔17〕;水蛭提取物在临床上具有抗脑缺血、改善侧支循环的功效〔18〕,而水蛭素兼具抗凋亡〔19〕作用;冰片可作用于紧密连接蛋白基因进而影响Bax/Bcl-2复合物而发挥抗凋亡作用〔20〕。然而以上研究均着重于此方治疗局部脑损伤,对于全脑损伤模型的研究较少。对于CA/CPR后全脑损伤者,有研究证实醒脑灌肠液可使CA/CPR模型大鼠的炎症因子白细胞介素(IL)-33/生长刺激表达基因2蛋白(ST2)表达下调〔21〕,从而有力证明本复方对CA/CPR后大鼠脑损伤具有抗炎功效。随着研究进展,探索凋亡通路在该疾病模型的中提供脑保护的可能是种延伸和新思路。安宫牛黄丸在CA患者〔22〕及各项动物实验研究〔23〕中显示,对于调节Bcl-2相关凋亡通路蛋白有显著药效,而CA/CPR后大鼠具有相似的病理生理机制,如脑缺血再灌注损伤及缺血缺氧性脑病机制,因此推测安宫牛黄丸在此模型中同样发挥抗凋亡作用,选用为阳性对照组药物。

窒息法行CA大鼠模型建立有很大优势〔24〕。窒息法作为Utstein模式的统一标准,在CA/CPR大鼠模型具有权威意义。模型制备过程中,总体可达到ROSC的成功率约50%,其中CA时间是较难把控的关键点,而本研究从夹闭气管到开始ROSC结束为止期间,进行了详细的时间记录,急救时肾上腺素用量也并非完全相同,但以上因素在组间对比后并无统计学意义。

本研究选取的权威NDS评分〔11〕,更加系统化、准确化的评估大鼠神经功能,分值越高神经功能缺陷越明显。细胞在凋亡的早期会出现特征性的萎缩,核固缩(染色质的不可逆凝聚)也同时发生在细胞凋亡的早期阶段。本研究CA/CPR模型神经细胞凋亡的病理染色与Chenoune等〔25〕研究结果一致。

Bax是Bcl-2的蛋白家族的重要成员。CA后,脑缺血/再灌注损伤达到一定程度,神经细胞进入应激状态,产生大量自由基,刺激信号使促凋亡成员如Bax和Bak激活,Bax和Bak通过形成线粒体外膜通透性(MOMP)复合物来启动细胞凋亡,进而导致线粒体膜上形成一个称为通透性转换孔(PT孔)的孔。之后线粒体释放促凋亡蛋白,如细胞色素C等形成凋亡体,从而使凋亡体激活Caspase-9的启动,进而导致Caspase-3的激活,最终诱导细胞凋亡。Caspase-3是在细胞凋亡执行阶段的中心分子,隶属于Caspases蛋白质家族,正常细胞中以不活跃的前体或酵素形式存在于细胞内。凋亡程序不论通过外源途径刺激还是内源途径转化,最后均可导致Caspase-3及家族成员激活,并导致细胞发生生化及形态学变化,破坏细胞骨架与核蛋白等,均为细胞凋亡的典型表现。Bcl-2是位于线粒体、内质网或核膜中的跨膜蛋白,主要起抗凋亡作用,具有4个不同的Bcl-2同源(BH)区域的多区域蛋白,即BH1～BH4。其中BH4是抗凋亡活性所必需的。为了避免细胞凋亡,Bcl-2或Bcl-xl等凋亡蛋白必须结合和隐藏BH3蛋白结合位点以阻止Bax/Bak激活。Bcl-2定位于内质网,通过抑制促凋亡蛋白来防止凋亡。Bcl-2或Bcl-xl过表达将抵消促凋亡蛋白针对线粒体外膜产生的改变,进而引起膜通道电位的变化,最终会导致线粒体肿胀和线粒体膜外膜的破裂,此时,BH3位点被占据,因此阻止了Bax/Bak激活,进而通过与B细胞受体相关蛋白(p28Bap)31结合介导Caspases的抑制,从而发挥抗凋亡作用〔26〕。

本文中大鼠生存统计中48 h成活率CPR组成活率较之XNGC组、AGNH组降低。结果提示,醒脑灌肠液和安宫牛黄丸的可能达到相近的神经保护效果。

综上,醒脑灌肠液在脑卒中患者及基础实验的抗凋亡、抗炎相关研究比较完善。本课题拓展了该方剂应用范围的可能性,并且为临床CPR后脑损伤及昏迷患者提供了治疗方向。醒脑灌肠液方剂不仅价格经济,而且给药方式为灌肠法,为CPR后的昏迷患者给药提供方便。本研究在基础实验方面提供了与安宫牛黄丸治疗效果可能相似的实验数据,为醒脑灌肠液更广泛的应用于临床提供可能。本研究不足之处在于仅探索醒脑灌肠液对凋亡相关蛋白表达的研究,并未探索其上游通路蛋白的表达。