空肠弯曲菌β1,3-半乳糖基转移酶（CgtB）突变体的设计及活性鉴定

邓梦雪， 杨秀怡， 龙云峰， 刘若兰， 刘行辉， 苏延停

（湖北科技学院 基础医学院，湖北 咸宁 437100）

糖基化修饰是一种最普遍的蛋白质翻译后修饰之一，调控蛋白质的诸多功能，例如蛋白质折叠、蛋白质的识别等[1]。 在近几十年，研究者已经在脊椎动物中发现了几百种糖基转移酶， 合成了7 000 多种糖结构[2]。 不同的糖链组成和连接方式使糖结构变得十分复杂，这给分析糖基化修饰造成了很大的困难[3]。

蛋白质的糖基化修饰根据连接的基团和氨基酸分为N-连接糖基化修饰和O-连接糖基化修饰。N-连接糖基化修饰过程起始于内质网，成熟于高尔基体，共价连接在天冬酰胺的氨基上。 而O-连接糖基化修饰主要发生在高尔基体，共价连接在丝氨酸或苏氨酸等的羟基上。O-连接糖基化修饰一般是以GalNAc 为第一个单糖直接结合氨基酸上，随后其他的单糖继续添加到GalNAc 后延伸。 缩短的O-连接糖链特别是只含有一个单糖即O-GalNAc 修饰在很多肿瘤细胞里出现了高表达，所以O-GalNAc 修饰又被称为肿瘤相关抗原即Tn 抗原[4]。 目前仍然不是很清楚Tn 抗原在肿瘤发展过程中到底扮演着什么样的角色。 在结肠直肠癌中，Tn 抗原可以结合树突状细胞和巨噬细胞表面的半乳糖凝集素即MGL，导致这些细胞活性受到抑制，最终肿瘤细胞发生逃逸[4]。 在乳腺癌中，高表达的Tn 抗原可以通过招募Galectin-3 和MUC1 使肿瘤细胞能够吸附在内皮细胞上，从而促进了肿瘤细胞的转移[5]。

目前识别O-GalNAc 修饰的工具很有限， 有很多文献报道能够识别O-GalNAc 修饰的单克隆抗体， 但是大部分抗体对O-GalNAc 修饰的识别依赖于2 个以上连续的O-GalNAc 修饰， 有些单克隆抗体还会对氨基酸序列有一定的依赖性，这样就导致了这类单克隆抗体可能对很多O-GalNAc 修饰的蛋白质的识别不敏感， 不适用于O-GalNAc 修饰的大规模鉴定[6-7]。 而凝集素仍然是广泛应用于识别这种修饰的有力工具，这些凝集素大多来源于植物和真菌。 目前发现了有很多凝集素可以识别O-GalNAc修饰，例如凝集素VVL、TL2、MPL、DBA 和Ricin 等[8]。这些报道识别O-GalNAc 修饰的凝集素都是由二聚体或者四聚体通过非共价连接， 特异性不专一，会结合其他的单糖例如galactose 末端糖结构。 综合而言， 目前并没有一个对O-GalNAc 修饰十分特异的凝集素，识别工具的缺乏也导致了对O-GalNAc 修饰的研究十分困难。

CgtB 是来源于空肠弯曲菌的β1,3-半乳糖基转移酶，CgtB 已经广泛用于体外合成O-连接糖基化修饰， 例如应用多操纵子原核表达元件同时表达CgtB、ppGalNAc-T2 糖基转移酶和目的蛋白质，成功表达出含有O-连接糖基化修饰的目的蛋白质[9]。对CgtB 的结构研究表明，不同菌株的CgtB 的N 端前108 个氨基酸高度保守， 可能是供体UDP-半乳糖的结合位点，而C 端则是受体糖蛋白（O-GalNAc修饰蛋白质）的结合位点，同时C 端去除30 个氨基酸后偶联MBP 标签会提高酶的效率[10]。对于糖基转移酶的改造有很多尝试，目前已有用来源于产气荚膜梭菌的糖苷水解酶的突变 （突变了活性位点，保留了糖结合活性）来识别相应糖基化修饰[11-12]。 对N-乙酰葡糖胺转移酶I(hGnT-I)的突变（截除N 端跨膜域）仍然能催化特异性糖基化[13]。作者所在团队对CgtB 进行基因改造， 将其N 端部分序列和C 端末尾30 个氨基酸删除， 从而只保留CgtB 对OGalNAc 修饰的结合活性。 通过原核表达，成功纯化出突变体CgtB 蛋白质即Cgt1， 通过糖蛋白结合实验证明了Cgt1 保持了结合O-GalNAc 的活性，并且可以作为识别肿瘤细胞中O-GalNAc 修饰的工具，这为进一步研究O-GalNAc 修饰打下了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株、质粒和培养基 pMal-c5x 质粒、克隆菌DH5α 和表达菌BL21（DE3）：购于武汉擎科生物公司，引物合成及基因测序由武汉擎科生物公司完成；LB 培养基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L；LA 培养基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠10 g/L， 琼脂粉20 g/L，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min 后备用。

1.1.2 主要试剂和抗体 Taq DNA 聚合酶、限制性核酸内切酶Nde I 和EcoRⅠ、DNA Ligation Kit、氨苄青霉素、MBP 层析柱及填料、丽春红染料：购于碧云天生物技术公司；考马斯亮蓝R-250 染料：购于Biosharp； 免疫印迹检测及ELISA 所用抗体： 购于Proteintech。

1.2 方法

1.2.1 CgtB 突变体Cgt1 的改造方案 首先将CgtB的C 端去除30 个氨基酸， 再将CgtB 的N 端去除30 个氨基酸即为Cgt1。改造的基因序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 Cgt1 突变体的目的基因扩增及质粒载体pMal-c5x 的双酶切 以改造的Cgt1 突变体的合成基因序列为模板进行扩增，1 g/dL 琼脂糖凝胶电泳，电压140 V， 电泳15 min， 回收扩增的目的基因片段。 Cutsmart Buffer 5 μL，pMal-c5x 质粒3 μg，限制性核酸内切酶Nde I 和EcoRⅠ各2 μL， 补ddH2O至50 μL，37 ℃双酶切30 min， 经1 g/dL 琼脂糖凝胶电泳回收。

1.2.3 重组质粒pMal-c5x-Cgt1 体系的构建 以10 μL DNA 无缝连接酶、3 μL Cgt1 基因扩增片段、1 μL pMal-c5x 质粒双酶切产物，补6 μL ddH2O 至20 μL 体系，50 ℃、20 min 无缝连接得重组质粒pMal-c5x-Cgt1，重组质粒图谱见图1。 取10 μL 重组质粒pMal-c5x-Cgt1 转入50 μL 的DH5α 感受态细胞中， 冰浴30 min，42 ℃热激1 min， 加入1 mL LB 培养基，37 ℃培养1 h，3 000 r/min 离心1 min。取下层100 μL 涂布于氨苄青霉素抗性平板， 过夜培养后挑取单菌落，37 ℃培养9 h 后菌液进行PCR初步验证，后进行单向测序进一步验证。 取阳性菌液扩大培养提取质粒， 将所提质粒转化到表达菌BL21（DE3）中。

图1 重组质粒pMal-c5x-Cgt1 的质粒图谱Fig. 1 Plasmid profile of the recombinant plasmid pMalc5x-Cgt1

1.2.4 Cgt1 的少量诱导 取Cgt1 阳性菌液于1 mL LB 培养基中，37 ℃扩大培养， 随后以1∶100 菌液体积比转入到10 mL LB 培养基中，37 ℃扩大培养2.5 h，至OD 值达对数期即0.6~1.0，然后加入IPTG使其终浓度为1 mmol/L，16 ℃、160 r/min 诱导12 h。菌液于12 000 r/min 离心1 min，弃上清液，用1 mL PBS 缓冲液重悬混匀沉淀。 超声破碎后于4 ℃、12 000 r/min 离心20 min。

1.2.5 Cgt1 的大量表达及纯化 取阳性菌液在1 mL LB 培养基中过夜扩大培养， 以1∶100 菌液比转入到10 mL LB 培养基中培养7 h， 随后转入到1 L的LB 培养基中，扩大培养约2.5 h 使OD 值达到对数期即0.6~1.0，然后加入IPTG 使终浓度为1 mmol/L，16 ℃、160 r/min 诱导12 h。将1 L 菌液于4 000 r/min离心20 min， 去上清液， 用40 mL 0.01 mol/L MBP缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl、200 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA, pH 7.4）将沉淀重悬混匀。 超声破碎，功率为200 W，破碎10 s，停10 s，共90 次。破碎完毕后于12 000 r/min 离心20 min， 收集上清液中蛋白质样品，过0.45 μm 滤膜除去不溶物。 上样于预先用MBP 缓冲液平衡好的MBP 亲和层析柱，流量为1 mL/min，上样完成后，用MBP 缓冲液洗去非特异性结合的杂蛋白质，直到蛋白质检测仪所测值不再变化，大约需1 h，最后用50 mmol/L 麦芽糖进行洗脱，收集洗脱峰，层析柱用ddH2O 洗涤后用体积分数20%乙醇洗涤后保存。

1.2.6 Cgt1 的ELISA 活性检测 用包被液（pH 9.6的NaHCO3）分别将黏蛋白（含有O-GalNAc 修饰，以O-连接糖基化为主）， Transferrin （含有NGlycans）标准糖蛋白稀释至10 μg/mL，每孔100 μL，4 ℃包被过夜。 吸出包被液， 用体积分数0.1%的PBST（PBS 缓冲液，体积分数0.1%的Tween 20）洗涤3 次， 用3 g/dL 的BSA 室温封闭1 h，PBST 洗涤3 次， 开始孵育质量浓度为20 μg/mL 的Cgt1 突变体蛋白质溶液，室温孵育1 h，用PBST 洗涤5 次，随后室温孵育鼠源MBP 一抗（1∶1 000）1 h，洗涤5 次后室温孵育羊抗鼠二抗（1∶5 000）1 h，PBST 洗涤5 次， 向每孔加入100 μL TMB 反应液避光显色，30 min 后加入100 μL、1 mmol/L 盐酸终止反应，用酶标仪检测每孔在450 nm 的吸光值。

1.2.7 Cgt1 对细胞中O-GalNAc 修饰的鉴定 分别准备两组相同的HeLa 和HepG2 细胞样品，同时制样，并于10 g/dL SDS-PAGE 分析，在Marker 的10 000 条带接近板底部时停止电源， 开始转膜至PVDF 膜上，5 g/dL 的BSA 室温封闭1 h。 一组室温孵育2 μg/mL Cgt1 蛋白质溶液；另一组室温孵育提前混合旋转1 h 的2 μg/mL Cgt1 蛋白质和50 mmol/L N-乙酰半乳糖胺的混合溶液1 h，即糖封闭过程，洗涤后于室温孵育鼠源GST 一抗（1∶2 000）1 h，随后室温孵育辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗（1∶5 000）1 h，显影液反应后，暗室显影。

2 结果与分析

2.1 Cgt1 突变体的基因改造分析

为增加其可溶性表达， 去除CgtB C 端的30 个氨基酸。 大量研究发现，不同菌株的CgtB 的N 端前108 个氨基酸高度保守，可能是供体UDP-半乳糖的结合位点，所以为了突变CgtB 的催化活性位点，将CgtB （C 端已经删除30 个氨基酸） 的N 端去除30个氨基酸即为Cgt1，改造路线见图2。

图2 CgtB 的改造路线Fig. 2 Transforming strategy of CgtB

2.2 Cgt1 突变体基因扩增及pMal-c5x 质粒双酶切结果

以合成的Cgt1 基因序列作为模版扩增目的基因，所得3 管PCR 扩增产物经1 g/dL 的琼脂糖凝胶电泳验证，见图3。 在800 bp 附近均有明显条带，与改造后的目的基因大小（753 bp）一致。 将双酶切质粒产物与酶切前的质粒经1 g/dL 琼脂糖凝胶电泳对照，结果见图4。可见双酶切后的质粒从3 条带变成1 条带， 并且酶切前后条带大小有明显差异，说明pMal-c5x 双酶切成功。

图3 Cgt1 突变体PCR 基因扩增Fig. 3 Gene PCR amplification of Cgt1 mutant

图4 pMal-c5x 质粒的双酶切Fig. 4 Double enzyme digestion of pMal-c5x plasmid

2.3 重组质粒转化后的PCR 验证

将重组质粒转化到克隆菌DH5α 后，随机挑取2 个单克隆菌落在1 mL LB 培养基中培养扩大，9 h后以1 μL 菌液作为模板进行PCR 验证，1 g/dL 琼脂糖凝胶电泳结果见图5。 可见2 个单克隆菌落均在800 bp 左右有明显条带，与预期大小一致，初步判断为阳性。 取该菌液进一步测序验证，其序列均完全符合，为阳性。

图5 pMal-c5x-Cgt1 重组质粒体系的菌液PCR 验证Fig. 5 PCR validation for pMal-c5x-Cgt1 recombinant plasmid system

2.4 Cgt1 突变体的表达及纯化

取未诱导的阳性菌上清液和IPTG 少量诱导的阳性菌上清液各400 μL，蛋白质抽提制样（甲醇氯仿抽提，V蛋白质液∶V甲醇∶V氯仿为4∶4∶1）， 经SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色，结果见图6（a）。 Cgt1 可溶性表达，随后大量表达Cgt1 蛋白质。 将上样前的蛋白质液和MBP 亲和层析柱纯化收集到的2 个样品即50 mmol/L 麦芽糖的洗脱液、穿流液，各取200 μL 分别进行蛋白质抽提制样（甲醇氯仿抽提，V蛋白质液∶V甲醇∶V氯仿为4∶4∶1）。 与超声破碎后的沉淀样品经SDSPAGE 和考马斯亮蓝染色，结果见图6（b）。 可见目的蛋白质Cgt1 富集于50 mol/L 麦芽糖的洗脱液中，条带纯度较高，和预期大小（70 000）一致。 用PBS反复超滤置换原始的缓冲液，超滤后测得Cgt1 蛋白质的终质量浓度为0.5 mg/mL。

图6 Cgt1 的表达与纯化Fig. 6 Expression and purification of Cgt1

2.5 Cgt1 的ELISA 活性检测

Cgt1 的ELISA 检测结果见图7。结果显示，Cgt1能特异结合O-GalNAc 修饰的mucin 标准糖蛋白，而对BSA 和含有N-连接糖基化的Transferrin 即转铁蛋白没有结合活性， 该结果说明Cgt1 保留OGalNAc 结合活性。

图7 Cgt1 对不同糖蛋白的结合Fig. 7 Bindings profiles of Cgt1 to different glycoproteins

2.6 Cgt1 对不同肿瘤细胞中的O-GalNAc 修饰鉴定

Cgt1 作为糖识别工具的免疫印迹结果见图8。在HepG2 和HeLa 复杂肿瘤细胞样品中，Cgt1 均鉴别到大量O-GalNAc 修饰信号，该结果证明Cgt1 具有O-GalNAc 修饰结合活性。

图8 Cgt1 对不同肿瘤细胞的O-GalNAc 修饰鉴定Fig. 8 O-GalNAc modification in different tumor cells identified by Cgt1

3 结 语

作者所在课题组通过改造CgtB 的基因， 突变其催化活性位点，保留其糖结合位点，实现了其突变体Cgt1 在大肠杆菌中的大量表达、MBP 亲和层析柱纯化，并在纯化后验证了Cgt1 对O-GalNAc 修饰的结合活性。 通过糖蛋白结合实验，证明Cgt1 保留了其O-GalNAc 修饰结合活性， 并且可以作为鉴别O-GalNAc 修饰的鉴定工具， 这对O-GalNAc 修饰的研究起到了极大的推动作用。