T细胞免疫与WAIHA发病的关联研究进展

彭薇，宋雅琴，韦爱萍，周秀英，温谋 综述 谢政军 审校

遵义医科大学第五附属(珠海)医院血液内科，广东 珠海 519100

温抗体型自身免疫性溶血性贫血(warm autoimmune hemolytic anemia，WAⅠHA)是多种诱因作用下机体产生大量抗自身红细胞膜蛋白或补体的自身抗体(ⅠgG 型多见)，在37℃左右可与自身红细胞最大程度结合，继而发生溶血的一组疾病。根据诱因不同又分为原发性和继发性，随着对于更多继发性免疫异常所致WAⅠHA 的认识，原发性的比例会逐渐下降。WAⅠ-HA是一种罕见疾病，发生率在1/10～3/10万/年，是自身免疫性溶血性贫血最为常见的类型[1]，70%～80%的成人和50%的儿童自身免疫性溶血性贫血是WAⅠHA[2]。

人们对WAⅠHA 的认识经历了一个漫长的过程，目前确认WAⅠHA对红细胞的免疫损伤主要看两个方面：一是患者的红细胞体外培养寿命缩短，二是通过DAT和ⅠAT检测到患者红细胞上结合有自身抗体和血清中有大量自身抗体，而该抗体是由于异常B淋巴细胞最终分泌产生的，所以很长一段时间以来都认为WAⅠHA 是体液免疫异常所致的自身免疫性疾病。针对这一发病机制的糖皮质激素、人免疫球蛋白、脾切除、其他免疫抑制剂的病因治疗虽然可使90%以上的WAⅠHA 得到有效控制。但是多数停药后又会反复，30%～50%会演变为复发难治型WAⅠHA[3-5]。

这一部分复发难治型WAⅠHA是否有不同的免疫细胞机制？在引起WAⅠHA 发病各个阶段都需要T 淋巴细胞及其他免疫辅助细胞参与，这些细胞在WAⅠHA 的发病中扮演什么样的角色和起到什么样的作用？近年来人们在这些方面展开了多种研究，本文主要就T 淋巴细胞在WAⅠHA 发病过程中的作用及引起该免疫变化的相关分子通路予以综述。

1 T细胞在机体免疫调控中的角色及作用

T 细胞激活是一个复杂的过程，需要初级识别信号和共刺激信号等多个细胞信号通路协同作用，是T细胞在机体免疫调控的基础：

1.1 第一信号 第一信号由抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC)提供，DC细胞(dendritic cells，DC)是目前发现唯一能启动初始T 淋巴细胞应答的APC，起着链接先天免疫和适应性免疫的重要作用，当因体内或环境温度达37℃自身细胞发生免疫耐受失衡或因病毒感染而发生抗原性改变时，未成熟的DC细胞被激活，其表面的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)与T细胞抗原受体相结合，随DC细胞移位至二级淋巴器官。成熟的DC细胞高表达内源性MHCⅠ类和外源性MHCⅡ类分子，分别激活CD8+T 细胞，介导抗原特异性细胞毒性效应；以及激活CD4+Th 细胞，介导辅助T 细胞效应，为T 细胞提供了第一信号[6-7]，从细胞免疫方面提升机体的抗感染能力。

1.2 第二信号 当T细胞与抗原相遇后，共刺激信号分子的存在为T细胞活化提供了第二信号，当DC细胞在移行过程中可高表达B7 蛋白，主要分为B7-1(CD80)和B7-2(CD86)两类抗体，可分别与Ⅰg 超家族成员CD28 及CTLA-4 相结合[8]，促使T淋巴细胞增殖及ⅠL-2因子的分泌，控制着T 细胞的初始启动和分化等许多方面[9-10]；若缺失则会使T 细胞呈失能状态，特征性地表现为T细胞不能进行增殖或合成ⅠL-2，继而导致无法产生正常的免疫反应，阻断该途径可能为未来治疗T 细胞介导的自身免疫性疾病的有效方法之一[11]。另外CD69 为近年来共刺激信号的研究热点，具有早期活化诱导Th细胞的作用，能加速其增殖并破坏机体免疫耐受，驱使T细胞募集至炎症部位，启动红细胞杀伤功能。邢莉民等[12]和董敏等[13]的研究发现，CD4+CD69+T高表达于AⅠHA患者外周血中，并与疾病严重程度呈明显负相关；刘波等[14]通过回顾性分析研究发现，AⅠHA患者外周血中CD4+CD69+T细胞占比经临床治疗后显著下降，预示其与病情的严重程度密切相关，可作为AⅠHA治疗后疗效评估监测的指标。

1.3 第三信号 在第一信号和第二信号的基础之上，第三信号即细胞因子的参与使T 能力得到完全发挥，如ⅠL-1 与抗原协同使CD4+T 细胞活化，ⅠL-2 可使表达高亲和力ⅠL-2Rα亚基的调节性T 细胞有效扩增[15]，ⅠL-7 与ⅠL15 协同维持记忆性T 细胞的生存，ⅠL-12 和ⅠFNα/β使CD8+T 细胞具有对各种体内刺激作出反应的能力[16]，ⅠL-21 作为Th17 细胞的自分泌生长因子发挥免疫调节作用[17]等。

2 T细胞免疫失衡是WAIHA发病的主要环节

T细胞在被三种类型的信号共同激活活化后募集至炎症部位，辅助T 细胞(helper T cell，Th)、调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)及细胞毒性T 细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL/cytotoxic T cell，Tc)发挥免疫调节作用，是既往学者研究及治疗的主要机制。

2.1 Th 细胞在WAⅠHA 发病机制中的作用 Th在成熟DC 细胞的刺激影响下分化成不同亚群，其间协同或制约失调与WAⅠHA的发病密切相关。

2.1.1 Th1/Th2 Th1 和Th2 是Th 细胞中的重要调节亚群，其中Th1 主要分泌ⅠL-12、ⅠFN-γ、TNF-β，可激活巨噬细胞、诱发迟发型超敏反应和清除胞内病原体；Th2 细胞能够分泌ⅠL-4、ⅠL-5、ⅠL-6、ⅠL-10、ⅠL-13，具有激活体液免疫、促进抗体生成的作用；Th1 与Th2 细胞相互制约，当平衡破坏后，即会导致免疫疾病的发生和发展[18]。Fagiolo 等[19]的实验表明AⅠHA中基础ⅠL-4、ⅠL-10 合成增加和ⅠFN-γ、ⅠL-12 水平降低，导致Th1 细胞因子衰减，Th2 细胞因子亢进，Th1/Th2 平衡紊乱。陶叔超[20]在对AⅠHA 患者的临床研究中发现，利妥昔单抗可通过上调T 淋巴细胞改善Th1/Th2平衡状态，达到治疗贫血目的。

2.1.2 Th17 Th17 细胞具有分泌大量炎症介质ⅠL-17A 的特性，可通过分泌ⅠL-17A、ⅠL-17F、ⅠL-21和ⅠL-22 等促炎性因子作用于上皮细胞和内皮细胞、成纤维细胞、中性粒细胞和单核/巨噬细胞等多种细胞细胞，介导炎症的发生[21]。Hall等[22]通过实验发现AⅠ-HA 患者外周血中ⅠL-17A 水平较健康对照组显著升高，与血红蛋白呈显著负相关，提出诱导Th17 细胞因子表位应作为AⅠHA 的治疗靶点。Xu 等[23]建立马歇尔-克拉克和普莱费尔模型诱导B6 小鼠患AⅠHA，实验说明Th17细胞与AⅠHA的疾病活动密切相关，并参与了该病的发生发展，起着主要驱动因素。

2.1.3 Tfh和Tfr T 滤泡辅助细胞(follicular helper T，Tfh)和T 滤泡调节(follicular regulatory T，Tfr)细胞是淋巴滤泡生发中心中辅助B淋巴细胞产生自身抗体的核心。Tfh独立于Th1、Th2、Th17分化，主要通过ⅠL-21R 发挥作用，具有辅助B 细胞产生抗体的作用；Tfr细胞具有Tfh和Treg细胞的共同特征。Gao等[23]通过实验发现AⅠHA 小鼠模型中的CD4+CXCR5+CD25-Tfh 细胞数量增加，导致Tfh∶Tfr 的比率高，且增加的Tfh 细胞活性与红细胞的免疫反应相关，提示Tfh细胞在AⅠHA发病机制中发挥作用。

2.2 Tregs 在WAⅠHA 发病机制中的作用 Tregs是维持机体免疫耐受的重要细胞，维护了机体正常免疫反应，是学者研究WAⅠHA 等自身免疫性疾病的重点机制[24]。Tregs属于免疫抑制性细胞，膜表面表达的CD25+、CD4+和核内表达的叉头盒蛋白3 转录因子共同组成细胞的标记物并分泌TGF-β、ⅠL-10 等细胞因子，发挥负性调节的重要作用。在Tregs 的表达机制中，当CD25+表达时，可结合并清除增殖细胞因子ⅠL-2，Foxp3 则充当Tregs 表达的主调节因子[25]。Toomer等[26]通过分子敲除模型说明，若CD25 或Foxp3 缺失，Tregs 则出现调节异常，可引起自身免疫性疾病发生。肖捷等[27]通过检测患者外周血发现，AⅠHA 初治组及复发组Tregs 比例较完全缓解组及健康对照组均低，提示Tregs 与AⅠHA 患者的细胞免疫紊乱可能有关。Kumar等[28]的实验表明增强调节性T细胞可恢复自身免疫性疾病中的自我耐受性。另外，随着近年来研究条件的优化，学者也开始研究CD8+Tregs 在AⅠHA 中的调节机制，在人体中主要表型有CD8+CD28-Foxp3+、CD8+CD45R+Clow、CD8+CXCR3+等。CD8+CD28-Foxp3+的研究较为深入，它是一个独特的Tregs亚群，可诱导活化CD4+T 细胞调亡，并降低CD25 和CD69 的表达水平，另一方面细胞毒性细胞的减少也被认为是通过诱导效应细胞凋亡来抑制Tregs的另一种机制，目前在再生障碍性贫血性贫血[29]、特发性血小板减少性紫癜[30]中研究较多，这可能成为将来研究WAⅠHA的方向之一。

2.3 CTL/Tc 在T 细胞的调节中，除Th 细胞和Treg 细胞发挥着至关重要的作用，细胞毒性T 细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL/cytotoxic T cell，Tc)与Th细胞的动态变化也是研究者关注的机制之一。在CTL 中发挥主要作用的是CD8+，其不仅充当表面标志，并且具有抑制T 细胞活化和B 细胞产生抗体的功能，在体液及细胞免疫中发挥重要效应。既往学者研究两者的平衡调节主要是通过研究CD4+/CD8+比例变化，间接反映了机体的免疫功能状况。研究发现，AⅠHA 患者CD4+T 百分率及CD4+/CD8+比例均显著降低，可能存在T 细胞免疫功能低下，而CD4+亚群Th1/Th2、CD8+亚群Tcl/Tc2 的失衡，Th2 细胞功能异常及ⅠL-2、ⅠFN-γ、ⅠL-4、ⅠL-5、ⅠL-10 等细胞因子的异常分泌也有发挥作用[31-32]。

3 影响WAIHA发病中T细胞免疫紊乱的重要分子通路

T 细胞的生成有许多重要的信号通路也参与其中，目前已知机制主要是通过Tregs 和Th17 等T 细胞的上游影响着免疫调节。

3.1 CD28/CTLA-4 共刺激信号通路 CD28/CTLA-4 是T 细胞上的最典型的共刺激信号通路之一，其与共刺激分子CD80和CD86形成两个嵌套的拮抗反馈回路，主要通过调节CD4+Th 的激活和增加Tregs 来调节T 细胞激活。其中CTLA-4 分子组成性表达于Tregs，表明CTLA-4在维持T 细胞稳态和耐受性方面具有效应T细胞内在作用，是Treg 功能所必需的。Wing 等[33]通过小鼠实验发现，当Tregs 中特别缺乏CTLA-4 时，小鼠可死于致命的淋巴组织增生性疾病，类似于在全部CTLA-4 KO 动物中看到的疾病。Krummey 等[34]通过小鼠实验研究证明了该反馈回路可微调Th1 和Th17 细胞反应，减少极化Th17 细胞的数量，为WAⅠHA的T细胞功能影响提供了研究方向。

3.2 Ca2+-Calcineurin-NFAT通路 NEFT家族是活化的T 细胞核内因子(nuclear factor of activated Tcells，NFAT)，为Ca2+的下游通道之一，可引导幼稚的CD4+T 细胞分化成不同的效应T 细胞亚群，在NFAT中，NFAT1～4 均由Ca2+激活，每种因子的作用效应不同，但均对T细胞具有调节作用，是T细胞的发育和成熟过程所必需的一部分。Ghosh 等[35]研究表明，活化NFAT1 在Th17 的ⅠL-17 和ⅠL-10 的转录上调中起直接作用，且充当T 细胞激活下游多个不同途径(Th1/Th2/Th17/Treg)的看门人，其过度活化可能是WAⅠHA的发病机制之一。Lozano 等[36]研究表明Treg 分化是通过NFAT的抗原刺激启动的，Foxp3必须与NFAT形成合作复合物才能与靶基因结合，来发挥免疫作用，FOXP3/NFAT1 相互作用可以增强T 细胞免疫。而Jyothi等[37]的研究表明，NFAT2的缺乏可引起ⅠL-4和Th2分泌减少，使ⅠgE和ⅠgG1抗体滴度下降，这些研究提示NFAT途径可能在WAⅠHA的发病中发挥一定作用。

3.3 JAK/STAT 通路 Janus 激酶/信号转导和转录激活子(janus kinase/signal transducer and activator oftranscription，JAK/STAT)通路几乎介导所有的免疫调节过程，STAT 因子被确定为多种途径的关键节点[38]，该通路的活化决定了T细胞的分化方向，其中STAT3 蛋白过表达可诱导Th17 分化及磷酸化抑制Tregs 的发育和ⅠL-2 的产生，而STAT5 蛋白在Treg 细胞前体的Foxp3诱导中起重要作用，过量的ⅠL-2 信号使STAT5磷酸化，它与Foxp3位点结合并诱导Tregs过表达，引起Th17/Treg失衡[39]，可能成为WAⅠHA发病原因之一。

3.4 PⅠ(3)K/Akt/mTOR通路 PⅠ(3)K/Akt/mTOR级联构成ⅠL-2 下游的主要信号通路，与Tregs 代谢稳定性和抑制功能密切相关[40]。当PD-1 与其配体结合可阻断T细胞信号分子CD28介导的PⅠ(3)K通路，抑制T细胞的增殖和分化[25]。miR-15b/16通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋PⅠ(3)K-Akt 通路，上调Tregs 的表达和其抑制功能[41]，说明了该通路与T细胞的调节密切关联。另外还有一些转录因子如c-Rel、Smad2/3、ATF、AP-1和Nr4a 也参与了Foxp3 的表达，可能与WAⅠHA的发病有关，但目前相关研究较少，可作为未来WAⅠHA疾病机制进一步研究的方向。

4 其他免疫辅助细胞分子在WAIHA 发病机制中的作用

除了T 细胞的自身及分子通路的调节之外，还有一些其他免疫辅助细胞分子在WAⅠHA的发病中也有着不可或缺的作用。

4.1 单核-巨噬细胞系统 WAⅠHA 患者机体在37℃时，单核细胞表面的不同Fc 受体(Fc receptors，FcR)结合致病性ⅠgG，诱导单核细胞分化成巨噬细胞，吞噬清除被致敏和包被的红细胞，引起溶血性贫血的发生[42]。其中FcγRⅠ与FcγRⅡa 含有免疫受体酪氨酸活化基序，FcγRⅡb则起着抑制作用，FcγRⅢ具有低亲和力使免疫性疾病的易感性增加。Sietse 等[43]通过检测AⅠHA 病例不同组织中FcγR亚型的表达，发现与外周血单核细胞相比，红髓巨噬细胞主要表达低亲和力受体FcγRⅡa 和FcγRⅢa，不表达抑制性FcγRⅡb，并且表达高亲和力受体FcγRⅠ，这可能具有治疗意义，因为FcγR及其信号传导最近已成为自身免疫性疾病的方向。

4.2 CD47 信号 为平衡Fc 受体介导的吞噬作用，红细胞膜上存在一种普遍表达的跨膜蛋白CD47，被研究者认为是一种“别吃我”的信号通路和先天免疫检查点，在红细胞稳态中起着至关重要的作用[44]。CD47与巨噬细胞以及其他骨髓细胞上存在抑制性受体信号调节蛋白α(SⅠRPα)结合，将细胞标记为“自我”，使红细胞产生自我保护作用。当炎症、感染等发生时，TSP-1 与CD47 相结合，为SⅠRPα创建一个新的结合位点，转化成“吃我”的信号，可将红细胞从循环中清除[45]。Sanne M 通过F (ab') 2 阻断CD47 抗体，确定了CD47 在ⅠgG 介导的脾脏RBC 吞噬中的作用，验证了ⅠgG 调理作用和CD47 是吞噬作用的主要平衡决定因素。并发现AⅠHA 患者红细胞中存在CD47 表达的缺失，比健康对照组的红细胞更容易被吞噬，考虑是患者的红细胞除了增强中性粒细胞(例如补体)的吞噬作用外，还具有额外的“吃我”信号，加重溶血的发生[46]。

5 结语

WAⅠHA 是一组以自身红细胞溶解破坏为主的溶血性贫血，周期性、间断性体内抗红细胞膜抗体升高致敏红细胞是溶血发生的主要始动因素。现有的治疗手段通过切断自身抗体与红细胞结合、抑制产生抗体的B淋巴细胞可以有效控制大部分的WAⅠHA，但是仍有30%左右的WAⅠHA 演变成复发难治型WAⅠHA，成为困扰临床的难题。

于是人们开始思索以上对于WAⅠHA发病机制的认识可能只是“冰山一角”，背后还有T淋巴细胞作为推手在WAⅠHA尤其是复发难治型中发挥作用。近年来围绕T 细胞的系列研究似乎揭示了WAⅠHA 发病过程中的重要病理节点，今后通过对这些关键病理节点的控制及阻断可能为WAⅠHA的治疗带来希望和革新。