不同产地金花白茶滋味代谢物组成及差异分析

孙红玉，陈义琴，石琳琳，罗娟，赵楠楠，肖力争，3，4*

（1.湖南农业大学 茶学教育部重点实验室，湖南 长沙 410128；2.湖南农业大学 国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128；3.湖南农业大学 植物功能成分利用省部共建协同创新中心，湖南 长沙 410128；4.湖南农业大学 农业农村部园艺作物基因资源评价利用重点实验室，湖南 长沙 410128）

金花白茶是采用白茶为原料，融合“发花”技术制成的紧压白茶产品。“发花”是指以采用合适茶叶原料蒸压成紧压茶后，在烘房中通过控制外界温、湿度等环境条件，促使优势微生物——冠突散囊菌（Eurotium cristatum）生长繁殖的过程[1]。冠突散囊菌在茶砖或茶饼内产生，形似米兰花，色泽金黄艳丽金黄色闭囊壳（俗称“金花”）。冠突散囊菌是一种常见于茯砖茶中的益生菌，随着对其研究的深入，学者们发现在其他茶类上均能培育出冠突散囊菌[2-3]，且能够改善粗老茶叶的品质，“发花”具有提高中低档白茶品质的潜能[1，4-5]。非靶向代谢组学侧重于检测尽可能多的代谢物组，在分析茶叶等复杂食品时是一种有价值的工具，能应用于分析茶叶的品质差异性和风味特征，已经被应用于研究绿茶、红茶、乌龙茶、青砖茶、黑茶[6-10]等茶叶中的差异代谢物和代谢物的变化规律。目前，对金花白茶的研究主要集中在通过气相色谱-质谱联用仪测定香气和液相测定儿茶素组分，来探究“发花”对白牡丹和寿眉等白茶原料的风味品质影响[1，4，11]。福建政和白茶是由国家级良种福安大白茶的鲜叶加工而成的产品，香气较清纯，滋味清鲜醇爽[12]；湖南汝城白茶的加工品种为湖南四大地方特色茶树种质资源之一的汝城白毛茶[13]，该品种呈现水浸出物和茶多酚含量高[14]等品种特点，花香浓郁持久，滋味鲜、甜醇；云南景谷白茶是以景谷大白茶为原料加工而成的产品，具有甜香和果香，滋味甜醇鲜爽[15]，是云南特色茶叶产品。本研究以福建、湖南和云南3 个省的经典白茶为原料，融合“发花”工艺，基于感官审评、代谢组学分析并结合多元统计分析的方法，探讨不同原料的金花白茶代谢物组成及差异，研究结果将有助于进一步了解不同原料加工的金花白茶成品品质风味的形成和差异性，为金花白茶品质分析及保健功能的挖掘提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验采用的3 种白茶原料分别来自福建政和、湖南桑植和云南景谷3 个产地。政和白茶（M-ZH）、汝城白茶（M-RC）和景谷白茶（M-JG）分别由福安大白茶、汝城白毛茶和景谷大白茶茶树品种的鲜叶制成。所有白茶均为2021 年9～10 月在相应的产区用一芽三叶鲜叶加工制成的白茶，随后于2021 年11 月按照发花工艺（原料→筛分整理→汽蒸→渥堆→称茶和蒸压→发花→干燥→成品）加工制得金花白茶，分别称为政和金花白茶（J-ZH）、汝城金花白茶（J-RC）和景谷金花白茶（J-JG），按照五点取样法取样后，-4 ℃低温密封保存备用。

1.2 仪器与试剂

甲醇、甲酸、醋酸铵（色谱纯）：德国赛默飞世尔科技公司；Vanquish UHPLC/Q ExactiveTMHF 液相色谱-质谱联用仪、Hypesil Gold column（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）色谱柱：德国赛默飞世尔科技公司；D3024R 低温离心机：美国Scilogex 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 金花白茶加工工艺和样品处理

工艺参数以湖南安化茯砖“发花”工艺为基础，结合预试验及生产实际确定基本加工工艺为白茶（50 kg）→1 次汽蒸（145 ℃、10 s）→渥堆（13 h）→2 次汽蒸（145 ℃、10 s）→手筑压制（选用500 g 手筑茶砖模具）→发花（调温控湿自动化烘房，历时12 d）→干燥（18 d）→成品金花白茶。

选用3 个产地的白茶加工成金花白茶作为样品，参照GB/T 8302—2013《茶取样》，取成品金花白茶150 g，采用液氮固样方式后，-4 ℃低温冰箱密封保存，试验前通过微型植物粉碎机粉碎茶样待用。

1.3.2 茶叶感官评价

茶叶感官评价由5 名茶叶审评专家组成审评小组，成员均已取得国家高级评茶员职业资格。按国家标准GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》进行感官审评。

1.3.3 代谢组学检测方法

茶样检测的前处理方法：取100 mg 液氮研磨的组织样本，置于EP 管中，加入500 μL 的80%甲醇水溶液；涡旋振荡均匀后，冰浴静置5 min，15 000 r/min、4 ℃离心20 min；取一定量的上清液加水稀释至甲醇含量为53%；15 000 r/min、4 ℃离心20 min，收集上清液，进样，采用液相色谱-串联质谱（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法进行分析。

质量控制样的制备：从每个试验样本中取等体积样本混匀作为质量控制样本（quality control，QC）。空白对照样的制备：53%甲醇水溶液代替试验样本，前处理过程与试验样本相同。色谱条件为柱温40 ℃，流速0.2 mL/min；流动相条件为正模式，流动相A 为0.1%甲酸，流动相B 为甲醇；负模式：流动相A 为5 mmol/L 醋酸铵，pH9.0，流动相B 为甲醇。

质谱条件：扫描范围选择m/z100～1 500；电喷雾离子源的设置为喷雾电压3.5 kV；鞘气流速0.241 MPa；辅助气流速）10 L/min；离子传输管温度320 ℃。

1.4 数据处理

将下机数据导入Compound Discoverer3.1 搜库软件后，对每个代谢物进行保留时间、质荷比等参数的简单筛选，然后通过分子离子峰和碎片离子进行分子式的预测并与mzCloud、mzVault 和Masslist 数据库进行比对，用blank 本去除背景离子，并对原始定量结果进行标准化处理，最后得到代谢物的鉴定和相对定量结果。应用软件SMICA14.1 进行主成分分析（principal component analysis，PCA）、层次聚类分析（hierarchical clustering，HCA）、偏最小二乘法判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA），进而得到变量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值并计算代谢物在两组间的差异倍数（fold change，FC）[16]。差异代谢物筛选的标准为VIP>1，P 值<0.05 且FC≥2。

2 结果与分析

2.1 金花白茶滋味品质特征感官分析

白茶和金花白茶的感官评价结果见表1。

表1 白茶和金花白茶样品的感官品质评价Table 1 Sensory quality evaluation of white tea and Jinhua white tea samples

由表1 可知，白茶均呈自然的萎凋状态，其中M-RC 干茶色泽最浅，M-JG 色泽最深，这与汤色相对应，M-ZH 汤色黄，M-RC 汤色浅黄，M-JG 汤色则为橙黄色，其中M-RC 的汤色最为明亮。在香气方面，白茶香气各具特色，整体香气新鲜愉悦，其“清香花香”显露出来，M-ZH 较清纯略带花香，M-RC 花香显，M-JG 花香较浓郁。白茶的滋味以醇为主，M-ZH 滋味较醇厚，M-RC 内含物丰富，滋味醇，较鲜爽，M-JG 滋味较浓厚且带花香。从叶底来看，M-ZH 和M-RC 的叶底较匀整，色绿褐，而M-JG 的叶底为尚嫩匀，有嫩梗，色红褐，三者以M-RC 的叶底最为壮实、叶肉肥厚。

3 种白茶制成的金花白茶外形端正，松紧适度，内部金花（冠突散囊菌）尚茂盛，J-ZH、J-RC 和J-JG 的干茶色泽分别为棕褐、灰褐和红褐。J-ZH 汤色呈橙红，较亮，J-RC 为橙黄，较亮，J-JG 则是红亮。J-RC 和JJG 的香气以菌香混合原茶香为主，而J-ZH 主要是菌花香显。叶底方面，J-ZH 绿褐，尚匀；J-RC 黄褐尚软嫩；J-JG 红褐带绿尚嫩软，有嫩梗。滋味方面，J-ZH 滋味较醇厚，有菌香，J-RC 滋味较醇厚，带花香，J-JG 滋味较醇厚，略涩；茶叶的感官品质主要依赖于其次生代谢产物，由此可初步推断，3 种金花白茶代谢产物差异较大，值得进一步探究。

2.2 代谢组学鉴定结果

金花白茶样品的PCA 分析和HCA 聚类分析结果见图1。

图1 3 个产地样品和QC 样本的PCA 主成分分析图和HCA 聚类图Fig.1 PCA score plot and HCA clustering plot for three origin samples and QC samples

由图1 可知，对J-ZH、J-RC 和J-JG 的代谢物进行高覆盖检测和正、负离子合并分析，政和金花白茶检测到代谢物1 406 个，汝城金花白茶1 209 个，景谷金花白茶1 227 个，三者相同的代谢物有616 个。为了确定3 种金花白茶的代谢物的差异情况，对检测到的代谢物进行主成分分析（PCA），其拟合参数R2X 为0.793，主成分1 和主成分2 的贡献率分别为37.5%和28.2%，3 组样品的PCA 分析见图1，同一种金花白茶的6 个重复样品距离较近，不同品种金花白茶的则相距较远，说明数据重复性较好。J-ZH、J-RC、J-JG 分别位于不同象限，具有明显区分，因此可以通过PCA 区分不同产地的茶样。通过HCA 聚类图1 可得，不同原料制成的金花白茶有明显区分，这也和感官评价结果相对应。

2.3 代谢组学差异分析

PLS-DA 是一种广泛使用的监督模式识别方法，政和金花白茶、汝城金花白茶和景谷金花白茶茶样通过PLS-DA 进行两两比对和置换检验后，以VIP>1，P值<0.05 且FC≥2 进行代谢物筛选，与此同时结合与茶叶品质密切相关的成分，例如氨基酸类、酚酸类、黄酮类、鞣质类和生物碱类等[17]，共筛选出149 个差异代谢物。3 种金花白茶的差异代谢物种类与变化情况见表2。149 个主要差异代谢物的相对含量分布见图2。

图2 差异代谢物的热图分析Fig.2 Heatmap analysis of differential metabolites

表2 差异代谢物种类与变化情况Table 2 Differential metabolite species and variation

由表2 可知，两种金花白茶相比得到的差异代谢物相对含量更多称为高表达，低表达则相反。包括JZH 相对于J-JG 有78 个差异代谢物，64 个呈高表达，14 个呈低表达；J-RC 相对于J-JG 有65 个差异代谢物，23 个呈高表达，42 个呈低表达；J-RC 相对于ZH有74 个差异代谢物，42 个呈高表达，32 个呈低表达。3种金花白茶中差异代谢物最多的为黄酮类，J-ZH、JRC 和J-JG 分别有27、25 个和29 个代谢物，最少是维生素，分别为3、2 个和1 个代谢物。

3 种金花白茶的重要呈味物质有79 个，见表3。

表3 重要呈味代谢物Table 3 Important taste metabolites

由图2 可知，横向代表茶样，纵向代表化合物，红色代表化合物在茶样中含量高于平均值，蓝色则相反，颜色深浅代表含量高低程度，3 种金花白茶被分离并聚类为3 类，与HCA 的结果一致。3 种金花白茶的差异代谢物中有4 个为三者相同的差异代谢物，分别是表没食子儿茶素（（-）-Epigallocatechin，EGC）、原儿茶醛（3，4-Dihydroxybenzaldehyde）、对香豆素（N-p-Coumaroylagmatine）、茶黄素-3，3'- 双没食子酸（Theaflavine-3，3-digallate），前3 种代谢物在RC 中相对含量较高，可以作为区分汝城金花白茶和其它两种金花白茶的标志性化合物。

续表3 重要呈味代谢物Continue table 3 Important taste metabolites

2.3.1 黄酮类化合物

黄酮类化合物是影响茶叶颜色和滋味的主要物质，冠突散囊菌能够显著提高白茶中黄酮类物质的总量[18]，3 个产地样品共鉴定出55 个黄酮类化合物，如图2a 所示，政和金花白茶中，甲基橙皮苷（Methyl-Hesperidin）、橙皮素（Hesperetin）、柚皮素（Naringenin）、山奈酚苷（Kaempferide）、牡荆素-4-O-葡萄糖苷（4'-OGlucosylvitexin）、槲皮素-3，4'-O-二β-吡喃葡萄糖苷（Quercetin-3，4'-O-di-beta-glucopyranoside）、槲皮素-3-α-L-阿拉伯氨基呋喃苷（Quercetin 3-alpha-L-arabinofuranoside）、杨梅素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷（myricetin 3-O-beta-D-galactopyranoside）、芹菜素-C-戊糖苷（Apigenin-C-pentoside）等黄酮苷类物质含量显著高于其他两种金花白茶；表没食子儿茶素（（-）-Epigallocatechin）、（-）-儿茶素没食子酸酯（CG，（-）-Catechin Gallate）和儿茶素（Catechin，C）这3 种儿茶素在汝城金花白茶中含量显著高于政和和景谷金花白茶的含量；景谷金花白茶与其他样品相比，茶黄素-3，3'-双没食子酸（Theaflavine-3，3-digallate）、茶黄素（Theaflavin）、没食子酸甲基酯（Methyl gallate）、原花青素A2（Procyanidin A2）、芦丁（Rutin）、山奈酚（Kaempferol）、双-C，C-戊糖基-芹菜素（di-C，C-pentosyl-apigenin）、槲皮素-3-O-葡萄糖苷-6''-乙酯（Quercetin-3-O-beta-glucopyranosyl-6'-acetate）等代谢物呈高表达。

儿茶素类是茶叶多酚类的主体部分，会引起口腔起皱的收敛性和粗糙的口腔感觉的涩味[19]，原花青素是一类由（+）-儿茶素和（-）-表儿茶素组成的低聚类黄酮，具有苦味，茶黄素、茶黄素-3，3'-双没食子酸具有皱缩涩味，这些化合物的增加会促进茶叶冲泡的强度和涩味[10]，由表3 可知，其相对总量呈J-RC>J-ZH>J-JG。黄酮醇常与糖结合生成糖苷，黄酮醇O-糖苷在低阈值浓度下，黄酮醇苷具有引起口腔干燥、丝滑、和柔软收敛性的涩味，且其呈味阈值浓度非常低，浓度范围从0.001～19.800 mmol/L[20]，其相对总量呈J-JG>JZH>J-RC。橙皮素为具有独特的风味的淡黄色固体和柚皮素均有增甜的作用[21]，相对总量呈J-ZH>J-RC>JJG。3 种金花白茶滋味较醇厚，但从黄酮类化合物的组成和相对含量可以推测，汝城金花白茶的收敛性稍强，景谷金花白茶口感更顺滑，政和金花白茶滋味则更甜醇。

2.3.2 氨基酸及其衍生物

氨基酸是鲜味的主要来源，氨基酸组分和其他化合物的含量比例与茶叶清、鲜、醇、厚等滋味特征的均表现关系密切，氨基酸多为小分子状态，这种趋势可能是由于冠突散囊菌在生长繁殖过程中能分泌各种水解酶，使茶叶中的蛋白质水解所致[22]。由图2c 可知，3 种金花白茶相比较，政和金花白茶中的L-（+）-精氨酸（L-（+）-Arginine）、2-羟基苯丙氨酸（2-Hydroxyphenylalanine）、L-苏氨酸（L-Threonine）、（S）-谷氨酸（（S）-Glutamic acid）、L-谷氨酸（L-Glutamic acid）、对称性二甲基精氨酸（SDMA）、S-腺苷高半胱氨酸（S-Adenosylhomocysteine）、L-丙氨酰-L-色氨酸（Ala-trp）、4-羟基异亮氨酸（4-Hydroxyisoleucine）、组氨酸（Histidine）、N6-乙酰-L-赖氨酸（N6-Acetyl-Llysine）、L-丙氨酰甘氨酸（Ala-Gly）、D-（-）-谷氨酰胺（D-（-）-Glutamine）等呈高表达；汝城金花白茶的氨基酸类物质主要有N-乙酰-L-苯丙氨酸（N-Acetyl-Lphenylalanine）、甘氨酰-L-苯丙氨酸（Gly-Phe）、S-（5-腺苷）-L-高半胱氨酸（S-Adenosyl-L-homocysteine）、N-甲基苏氨酸（N-Methylthreonine）呈高表达；景谷金花白茶有N-乙酰-L-天门冬氨酸（N-Acetylaspartate）、N-乙酰-L-酪氨酸（N-Acetyl-L-Tyrosine）、N-乙酰-DL-谷氨酸（N-Acetyl-DL-glutamic acid）、N-乙酰天门冬氨酸（N-Acetylaspartic acid）、N-（3-吲哚乙酰基）-L-丙氨酸（N-（3-Indolylacetyl）-L-Alanine）、吲哚-3-乙酸-谷氨酸（IAA-Asp）等氨基酸呈高表达。

由表3 可知，不同的氨基酸会呈现不同的味道，其中谷氨酸、谷氨酰胺、茶氨酸、蛋氨酸呈鲜味[23-24]，缬氨酸、丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸呈鲜味、甜味[23]，苏氨酸呈甜味[25]，呈鲜味和甜味的氨基酸的相对总量为J-ZH>J-RC>J-JG。组氨酸、精氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸均为苦味[24]，呈苦味的氨基酸的相对总量为J-RC>J-ZH>J-JG。故此汝城金花白茶的茶汤苦涩味略重。

2.3.3 糖类

茶汤中的甜度很大程度上来自于可溶性糖[23]。淀粉、果胶等大分子糖在果胶酶等物质的水解作用下形成单糖、双糖溶于茶汤，茯砖茶加工研究表明，冠突散囊菌在发花期间会产生纤维素酶和果胶酶，促进粗纤维物质转化形成小分子糖类[26]，政和金花白茶中呈高表达的糖类化合物种类较多，由图2b 可知，包括α-乳糖（α-Lactose）、异麦芽糖（Isomaltose）、麦芽四糖（Maltotetraose）、麦芽糖醇（Maltotriitol）、麦芽五糖（Maltopentaose）、N-乙酰-D-乳糖胺（N-Acetyl-D-lactosamine）、6-水杨酸乳糖（6-Sialyllactose）、D-（+）-阿拉伯糖醇（D-（+）-Arabitol）、L-（-）-阿拉伯糖醇（L-（-）-Arabitol）、卡那霉素水解物（Kanosamine）、C-戊糖基-木犀草素-C-己糖苷（C-pentosyl-luteolin-C-hexoside）等；汝城金花白茶的代谢物呈高表达的有N-乙酰-D-氨基葡萄糖（N-Acetylglucosamine）、苔黑酚葡萄糖苷（Orcinol glucoside）、当药甙（Sweroside）、霉菌赤藓醛糖（Nystose）；景谷金花白茶中则是D-葡糖酸（DSaccharic acid）和咖啡酸O-葡糖苷（Caffeic acid Oglucoside）呈显著高表达。D-木糖、麦芽三糖等均是呈现甜味物质的单糖或者二糖，N-乙酰-D-氨基葡萄糖可以作为糖尿病患者甜味剂，3 种金花白茶中呈甜味的糖类物质的相对总量为J-ZH>J-RC>J-JG，因此政和金花白茶的滋味甜度较高。

2.3.4 有机酸和芳香物质

有机酸在生化反应中作为糖类分解的中间产物，由图2d 可知，政和金花白茶中主要是2-异丙基苹果酸（2-Isopropylmalic acid）、DL-苹果酸（DL-Malic acid）、5-O-对香豆酰莽草酸（5-O-p-Coumaroyl shikimic acid）、α-乳香酸（α-Boswellic acid）等呈高表达，汝城金花白茶中呈更高表达的有机酸类代谢物包括3，4，5-三甲氧基肉桂酸（3,4，5-Trimethoxycinnamic acid）、O-对香豆酰-O-水杨酰奎尼酸（O-p-coumaroyl-O-salicyloyl quinic acid）、矮茶素（Bergenin）等。绿原酸（Chlorogenic acid）、D（+）-苯乳酸（D（+）-Phenyllactic acid）等在景谷金花白茶相对含量较高。苹果酸具有天然果实的酸味特征，具有更加醇厚的味觉，酸味柔和绵长[27]，如表3，苹果酸的相对含量呈J-ZH>J-JG>JRC，三者中政和金花白茶的口感更醇厚。

芳香差异物质一共鉴定出4 种，包括具有温柔的辛香和丁香香气的甲基丁香酚和乙酸丁香酚酯，有强烈的麝香气的麝香酮（Muscone），以及呈优雅的茉莉花香和芹菜籽香气的茉莉酮（Jasmone）。由表3 可得，前三种芳香物质在J-ZH 中的相对含量显著高于其他两种金花白茶，而茉莉酮在J-RC 中相对含量最高，推测其是汝城金花白茶茶汤中带花香的重要组成成分。

3 结果与讨论

本研究运用感官审评和代谢组学的方法，对不同原料（政和白茶、汝城白茶和景谷白茶）的金花白茶的差异代谢物进行了分析，共筛选出差异代谢物149 个，三者共有差异代谢物4 个，重要呈味代谢物79 个，3种金花白茶在黄酮、氨基酸和糖类化合物中都有明显的区分。结果显示3 种金花白茶差异显著，政和金花白茶的菌花香最为纯正且滋味更甜，汝城金花白茶汤带花香具有明显特色，景谷金花白茶的茶汤更顺滑且汤色最深，三者均滋味醇厚。

汝城金花白茶和景谷金花白茶聚为一类，区别于政和金花白茶，推测是受到了鲜叶原料来源的影响，汝城白毛茶种群遗传多样性与云南大叶茶亲缘关系较近[13]。景谷金花白茶中茶黄素类物质相对含量较高，这可能是由于原料本身儿茶素类物质含量丰富，在鲜叶加工成白茶过程中茶多酚类物质氧化和后期毛茶经过“发花”工艺进一步发酵，促使茶黄素和茶黄素-3，3'-双没食子酸的相对含量显著高于其他两种金花白茶。汝城金花白茶儿茶素类代谢物相对含量较多，黎娜等[13]研究发现汝城白毛茶的茶多酚、儿茶素含量与云南大叶种、江华苦茶、城步峒茶和云台山种茶树品种相比，含量较高，就此而言汝城金花白茶的滋味品质受原料影响较大。金花白茶是白茶市场上的新产品，不同白茶加工而成的金花白茶各具特色，三者相比政和金花白茶表现最优。后续有待研究金花白茶的香气，不同的发花工艺和发花环境等参数的变化对金花白茶品质的影响，该研究为金花白茶滋味品质的代谢物轮廓提供了依据，所检测到的物质可为政和金花白茶、汝城金花白茶和景谷金花白茶的品质差异和鉴别产地提供数据支持。