桃红四物汤对脑缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障通透性的保护作用及机制

侯欣宇,刘竹青,张亚南,戴文涛,武 瑞,韩 岚,3,彭代银,3

(1.安徽中医药大学药学院,安徽 合肥 230012;2.中药复方安徽省重点实验室,安徽 合肥 230012;3.新安医学教育部重点实验室,安徽 合肥 230012)

脑卒中发病的机制是脑血管闭塞阻碍大脑局部血流,致使血流供应障碍,脑动脉内形成血块,引起脑组织的缺血、低氧,导致一系列级联反应以及局部脑组织缺血性损伤或坏死［1］。研究表明,缺血区血液供应的恢复,反而致使缺血区损伤加重,即脑缺血再灌注损伤,出现脑水肿［2］、神经功能缺损［3］、血脑屏障破坏［4］和出血性转化［5］,威胁患者的生命健康。

血脑屏障是由单层的脑微血管内皮细胞、围绕在内皮细胞表面的星形胶质细胞和周细胞组成［6］,能够调节循环血液和脑实质之间物质的转运,维持中枢神经系统稳态。研究［7］表明,脑卒中会致使中枢神经系统血管功能变化,引起血脑屏障结构和功能损伤,导致血脑屏障破坏,而血脑屏障的破坏进一步导致血管源性脑水肿和出血转化［8-9］,从而加剧脑卒中后脑损伤。脑卒中属于中医“中风”“偏枯”或“偏风”等范畴,病机属气虚血瘀。桃红四物汤最早见于《医宗金鉴》,由桃仁、红花、川芎、当归、熟地黄、白芍6味中药组成,为补血调经、活血、祛瘀、生新的经典名方。课题组前期研究证实,桃红四物汤对缺血性脑卒中具有保护作用,可降低脑卒中炎症反应,保护正常神经功能以及促进血管新生,但桃红四物汤保护神经功能的作用是否与改善血脑屏障通透性以及紧密连接蛋白损伤有关尚不明确。本研究拟复制大鼠大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,观察桃红四物汤对脑缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障通透性的影响,探究其保护神经功能作用是否与减少紧密连接蛋白损伤,改善脑组织超微结构有关。

1 材料

1.1 动物 SPF级雄性健康大鼠80只,体质量(260±20)g,购于邳州市东方养殖有限公司,动物生产许可证号为SCXK(苏)2016-0010。每笼10只,自由活动,饮食饮水,保持室内通风,室温(25±1)℃,湿度(50±5)%,适应性喂养14 d。所有动物实验均经安徽中医药大学动物实验伦理委员会批准(伦理编号:AHUCM-rats-202287)。

1.2 药材及试剂 桃仁(批号1702181)、红花(批号17072135)、川芎(批号17010335)、熟地黄(批号1705312)、当归(批号1611085)和白芍(批号17110114)药材均购于安徽普仁中药饮片有限公司,其有效成分均符合2020年版《中华人民共和国药典》标准。尼莫地平:亚宝药业太原制药有限公司;2,3,5-氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride, TTC)、4%多聚甲醛、磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)粉末:碧云天生物技术有限公司;occludin(批号ab224526)、胞质附着蛋白(zona occludens, ZO)-1;(批号ab221547)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloprotein 9, MMP-9;批号ab76003):英国Abcam生物技术有限公司;Triton X-100:上海恒远生物技术有限公司。

1.3 仪器 SHZ-D(Ⅲ)循环水式多用真空泵:郑州市仪特仪有限公司;RE-52AA旋转蒸发器:上海亚荣生化仪器有限公司;Milli-Q超纯水机:上海默克化工技术有限公司;XB-70制冰机:南京先欧仪器制造有限公司;KD-P组织切片机:金华市科迪仪器设备有限公司;BHWY-100BC恒温振荡培养箱:常州杰博森仪器有限公司;全波长酶标仪:美国Thermo公司;低温冷冻离心机:湖南湘仪实验仪器开发有限公司;5417R高速冷冻离心机:德国Eppendorf公司。

2 方法

2.1 桃红四物汤的制备 将红花、当归、白芍、川芎、桃仁、熟地黄按照3∶4∶3∶3∶3∶4比例配制。将称量的各药材加入10倍容积的75%的无水乙醇中,浓缩后回流2 h,过滤残余物。将残余物与8倍容积的无水乙醇回流2 h,2次提取物合并,浓缩后制成1.8 g/mL的提取液,稀释至0.9 g/mL备用。

2.2 复制模型 线栓法复制MCAO模型,将大鼠麻醉后,仰卧固定。在大鼠颈部中间位置切口,分离左颈总、颈内和颈外动脉。在颈总和颈外动脉的靠近心脏一端处进行结扎,使用动脉夹将颈内动脉紧闭。从颈总动脉的远心端(距颈内和颈外动脉分叉处1 cm处)用剪刀剪一小口,插入过蜡后的鱼线(直径为0.25 mm)。经颈总动脉插入颈内动脉,进入颅内。颈总动脉和鱼线共同结扎,缝合皮肤,碘伏无菌操作。注射庆大霉素,大鼠俯卧保持呼吸通畅。2 h后拔出鱼线,再灌注24 h。假手术组大鼠只结扎颈外动脉与颈内动脉。手术期间注意给大鼠保暖。

2.3 分组及给药 将大鼠随机分为假手术组、模型组、桃红四物汤组和尼莫地平组,每组15只。桃红四物汤组按照9 g/kg(根据人和动物间体表面积折算的等效剂量比值计算,大鼠的剂量相当于成人临床剂量的6.3倍)灌胃桃红四物汤,尼莫地平组按照20 mg/kg灌胃尼莫地平。假手术组和模型组大鼠均给予等容积蒸馏水,共7 d,每日1次。

2.4 Longa分级评分评估大鼠神经功能 评分标准:0级,行为无明显变化;1级,左前肢屈曲,左后肢伸展;2级,有左侧追尾现象;3级,行走困难,摇摆不定;4级,无自发性活动,有意识障碍。

2.5 行为学实验评估大鼠运动功能

2.5.1 平衡木试验 术前3 d进行平衡木行走训练,使每只大鼠都能够顺利通过平衡木,限时1 min。评分标准:0分,稳定平衡姿势;1分,紧抱平衡木;2分,其中一个肢体从平衡木上掉落;3分,两个肢体从平衡木上掉落;4分,无试图平衡却跌落(>40 s);5分,试图平衡却跌落(>20 s);6分,试图平衡却跌落(≤20 s)。

2.5.2 转角试验 将大鼠置于两块亚克力板夹角至尾部垂直线的后1/2～2/3处,使大鼠能够前进,总共进行10次,记录小鼠左转或者右转次数。转角指数=(总转角次数-向左转角的次数)/总转角次数×100%。

2.6 TTC染色法观察脑缺血大鼠脑梗死面积 腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉大鼠,取出完整脑组织,去除小脑、嗅球等组织,只保留大脑,置-20 ℃冰箱里0.5 h后切片,放入2% TTC溶液,37 ℃下避光孵育约30 min。染色后置于4%多聚甲醛固定,24 h后滤纸吸干表明残留溶液。采用Image J软件计算各组大鼠脑梗死面积。

2.7 苏木精—伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察缺血侧脑部皮质的组织形态 腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉大鼠后,打开胸腔,生理盐水进行心脏灌注10 min,用4%多聚甲醛固定液再次灌注15 min,取出完整脑组织,去除小脑、嗅球等组织,只保留大脑,浸泡于4%多聚甲醛固定液中,4 ℃保存。脱水处理后石蜡包埋,切片,染色,封片,显微镜下观察缺血侧脑皮质的组织形态并采集图像。

2.8 大鼠脑组织含水率检测 腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉大鼠后取完整大脑,生理盐水冲洗,将全脑组织分成左、右两个半球,滤纸吸干表面的生理盐水,将缺血侧脑组织放在电子天平上称质量,记录缺血侧脑组织湿质量,放入100 ℃烘烤箱烘干24 h。烘干后再次称质量,记录缺血侧脑组织干质量。脑含水率=(湿质量-干质量)/湿质量×100%。

2.9 伊文思蓝(Evans blue, EB)染色法观察脑缺血大鼠血脑屏障通透性 大鼠尾静脉注射2%的EB染色液(4 mL/kg),体循环2 h后,腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉大鼠,经心脏灌流,观察大鼠心脏右心耳滴出无色透明液体后,取脑,称取脑组织0.5 g。将脑组织放入EP管内加入甲酰胺溶液(2 mL/g)浸泡。加入研磨球,放入组织研磨仪中低温匀浆,匀浆后取出,在60 ℃孵育24 h。放入12 000 r/min的低温离心机,4 ℃离心30 min,取上清液。吸取上清液20 μL加入96孔板,酶标仪620 nm处读取吸光度OD值。制备EB标准品浓度曲线,计算样品浓度。

2.10 出血性转化程度测量 大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉后用PBS进行灌注,观察右心耳出现无色透明的液体后迅速断头取脑,手术刀分离两侧大脑半球,收集缺血半球脑组织并称取脑组织约100 mg。加入1倍PBS快速匀浆,13 000 g离心30 min,取上清。取20 μL上清加入96孔板中,按照血红蛋白检测试剂盒说明书测定上清液中血红蛋白含量。

2.11 透射电子显微镜观察脑缺血大鼠血脑屏障紧密连接超微结构 取小鼠脑缺血侧皮质区1 mm3大小的脑组织,固定于2.5%戊二醛溶液,4 ℃保存;弃去原有固定液,将样本装入瓶中,经PBS漂洗过夜;再经PBS清洗3次,固定于1%锇酸,PBS清洗3次。依次按照30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%乙醇进行脱水,每次15 min。弃去无水乙醇后,加入100%丙酮浸透。丙酮与树脂按照1∶1比例作用1 h,更换为1∶2的比例作用2 h,更换纯树脂包埋过夜。切片,染色,透射电子显微镜下观察血脑屏障紧密连接超微结构并采集图像。

2.12 免疫组织化学染色法观察脑组织紧密连接蛋白occludin、ZO-1和MMP-9表达水平 将大鼠麻醉、取脑,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,切片。烘烤3 h,二甲苯浸洗。依次在100%、95%、85%、70%乙醇中浸洗5 min,PBS清洗。放入枸橼酸盐中处理,PBS清洗。放入3% H2O2-甲醇溶液处理,PBS清洗。加入一抗,放4 ℃冰箱里孵育过夜。取出切片,PBS清洗。于增强剂孵育0.5 h后PBS清洗。加入二抗,孵育30 min,PBS清洗。加入显色剂和苏木精染液。依次在70%、85%、95%和100%乙醇中浸洗,二甲苯浸洗,封片。显微镜下观察occludin、ZO-1和MMP-9表达水平。

3 结果

3.1 各组大鼠神经及运动功能比较 假手术组大鼠神经及运动功能无明显损害。与假手术组大鼠比较,模型组大鼠神经功能严重受损,行为出现明显障碍(P<0.05),表明模型建立成功;桃红四物汤组和尼莫地平组大鼠神经和运动功能明显改善(P<0.05)。见图1。

注:A.假手术组;B.模型组;C.桃红四物汤组;D.尼莫地平组;与假手术组比较,∗P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

3.2 各组大鼠脑梗死面积比较 假手术组大鼠脑部可见鲜艳的红色,无苍白色区域,未见脑组织损伤;与假手术组比较,模型组大鼠脑部苍白色区域显著增加(P<0.05)。与模型组比较,桃红四物汤组和尼莫地平组苍白色区域显著减少(P<0.05)。见图2。

注:A.假手术组;B.模型组;C.桃红四物汤组;D.尼莫地平组;与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

3.3 各组大鼠脑皮质的组织形态比较 假手术组大鼠脑皮质神经元结构完整、轮廓清晰,无明显病理变化;模型组大鼠缺血侧大脑皮质大量神经元出现结构破坏,细胞质浓缩,细胞核固缩、分裂甚至溶解的状态。并且神经元之间的排列杂乱、层次不清晰、间质水肿,病理损伤严重。桃红四物汤和尼莫地平组大鼠脑皮质的病理损伤均有所改善。见图3。

注:A.假手术组;B.模型组;C.桃红四物汤组;D.尼莫地平组

3.4 各组大鼠脑组织含水率及出血性转化程度比较 与假手术组比较,模型组大鼠脑组织含水率、出血性转化程度明显增加(P<0.05)。与模型组比较,桃红四物汤组和尼莫地平组大鼠脑组织含水率与出血性转化程度明显下降(P<0.05)。水肿与出血均有所改善。见图4。

注:A.假手术组;B.模型组;C.桃红四物汤组;D.尼莫地平组;与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

3.5 各组大鼠血脑屏障通透性比较 假手术组EB渗出量较低,模型组的EB渗出量明显增加(P<0.05),即血脑屏障通透性增加。与模型组比较,桃红四物汤组和尼莫地平组大鼠脑内EB渗出含量明显降低(P<0.05)。见图5。

注:A.假手术组;B.模型组;C.桃红四物汤组;D.尼莫地平组;与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

3.6 各组大鼠血脑屏障紧密连接超微结构变化比较 假手术组大鼠内皮细胞之间相邻的紧密连接呈现一条单独且明显的暗线,内皮细胞间紧密连接数量较多,细胞间隙狭窄,大鼠无血脑屏障的破坏。模型组大鼠的紧密连接数量减少,蛋白层变薄且不连续,细胞间出现间隙,内皮细胞水肿。桃红四物汤组和尼莫地平组细胞间紧密连接超微结构的异常变化明显减弱。见图6。

注:A.假手术组;B.模型组;C.桃红四物汤组;D.尼莫地平组

3.7 各组大鼠紧密连接相关蛋白表达水平比较 与假手术组比较,模型组大鼠脑梗死区occludin、ZO-1蛋白表达水平降低(P<0.05),MMP-9表达水平升高(P<0.05)。给予桃红四物汤和尼莫地平后occludin、ZO-1的表达水平显著升高(P<0.05),MMP-9表达水平显著降低(P<0.05)。见图7、图8。

图7 各组大鼠occludin、ZO-1、MMP-9表达水平比较(免疫组织化学染色,10×40倍)

注:与假手术组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

4 讨论

脑卒中属中医学“中风”范畴,脑卒中病理过程中产生的许多物质,如凝血酶、细胞因子等都可归纳为中医理论“瘀”的范畴,这些物质可以损伤血管内皮细胞、血脑屏障结构等,影响脑组织正常功能,并与脑卒中的不良预后密切相关。故在治疗、用药方面以祛瘀血、生新血、畅气机等法互相配合,辨证应用,祛除瘀阻,通畅气机。

血脑屏障在维持大脑中枢神经系统的特殊微环境及与全身多脏器交流中发挥着重要作用。血脑屏障破坏是早期缺血性脑卒中的特征之一,血脑屏障受到破坏致使脑部损伤和后续的神经功能损伤［10］。此外,其生化特征包括减少紧密连接所组成的蛋白表达,改变紧密连接组织结构,调节内源性血脑屏障转运蛋白的功能［11］。

越来越多的研究表明,血脑屏障的破坏与脑血管疾病密切相关,如脑出血、脑梗死、癫痫、动脉粥样硬化［12］和神经退化。研究［13］表明,动物脑卒中模型的出血性转化和脑水肿的发病机制可能由于血脑屏障的破坏而重叠。在内皮功能障碍的过程中,组织肿胀首先是血管内液的渗透,经毛细血管运动进入细胞外间隙(离子性水肿),随后进行血脑屏障的破坏,即紧密连接受损和血浆蛋白渗漏(血管源性水肿),最后是毛细血管完整性的损坏和外渗到脑实质。研究［14］发现,在MCAO后24 h,血管旁实质出现严重的组织水肿,微血管和基底膜的内膜结构模糊。同时,大鼠出现神经功能缺损、脑水肿、梗死体积扩大等情况。此外,脑微血管内皮细胞具有高度特征化的表型,其特征是细胞间紧密连接,紧密连接主要由细胞跨膜蛋白(occludin、claudin)、细胞胞质附着蛋白和连接黏附分子组成。这些紧密连接限制了分子在血液和脑之间的移动与扩散,在内皮层形成一道屏障,即相邻的脑微血管内皮细胞的膜结构紧密相连。occludin、claudin-5和ZO-1是反映血脑屏障功能的关键指标。ZO将claudin和occludin的细胞质尾端连接到肌动蛋白细胞骨架,以维持紧密连接结构［15］。研究［16］表明,大脑中动脉闭塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion-reperfusion,MCAO/R)大鼠缺血区星形胶质细胞端足不同程度肿胀。大鼠毛细血管内皮细胞之间的紧密连接结构变形,出现间隙裂隙。可见,血脑屏障在脑缺血后呈现明显的病理变化,与脑缺血疾病的进展及预后密切相关。

桃红四物汤是祛瘀生新的经典方剂,具有活血化瘀功效。桃红四物汤组成成分复杂,这也决定了其具有多种药理作用。目前,桃红四物汤的主要研究都是围绕着治疗血瘀相关疾病展开,包括活血化瘀、抗炎镇痛、神经保护等。研究［17］发现,桃红四物汤能够降低血瘀证缺血性脑卒中患者血压和毛细血管通透性,扩张梗死的脑血管,增加脑部血流量,从而改善脑部的微循环。课题组以往研究也表明,桃红四物汤可以减少氧化,缓解损伤,改善学习和记忆功能［18］,促进缺血性脑卒中血管生成［19-20］,抑制炎症与细胞焦亡［21-22］。本实验结果发现,桃红四物汤能够改善缺血再灌注大鼠神经及运动功能,缩小MCAO/R大鼠缺血侧脑梗死面积,改善大鼠梗死区脑皮质病理损伤,减轻MCAO/R大鼠脑水肿,调节血脑屏障通透性,修复内皮细胞间紧密连接结构,提高occludin、ZO-1表达水平,降低MMP-9蛋白的表达水平,改善出血性转化程度及恢复脑血流量,调节血脑屏障通透性,对脑缺血再灌注损伤具有良好的保护作用。