双水相临界萃取条件优化方法及其应用

曾颖，曾淑欣，何玉书，林韫琦

（厦门医学院，福建 厦门 361021）

双水相萃取技术（aqueous two-phase extraction，ATPS）作为一种新型分离技术，因其操作条件温和、连续性、易放大等优势，越来越受研究者的关注，并且已被广泛应用于生物化学、细胞生物学、生物化工和食品化工等领域[1-3]。双水相系统是当两种结构不同的聚合物或两种盐，或一种聚合物与一种亲液盐在适当的浓度或在一个特定的温度下相混合在一起时形成的互不相溶的两相系统[4]。

目前，在利用双水相技术或优化双水相体系的研究中，通常采用单因素控制变量法、正交设计[5]、响应面法[6]、关联方程式建模[7]等试验设计方法，探究各因素变量，如分子量、质量分数、系线长度（tie line length，TLL）、温度、pH 值等对双水相萃取效果的影响[8-14]。但由于双水相萃取技术的理论和分配机理相关研究较少，体系的物理、化学性质尚未完全清晰[15]，因此通过以单因素为基础的试验设计方法探究最优萃取条件存在一定的局限性[16]。在优化双水相体系过程中，各变量因素的分子之间容易产生新的相互作用力，特别是加入样品之后，原始的双节线会因为样品的缓冲液环境等因素干扰发生一定程度的偏移，导致成相规律发生变化，其成相临界点难以确定，因而在临界点附近的体系构成和优化鲜少被探究，致使优化后的体系往往不够全面，在实际应用方面会受到一定的限制且造成材料资源的浪费。本文提出一种针对双水相成相临界点萃取条件的试验设计方法，简称“52×3 双水相试验法”，是专门为优化双水相临界萃取体系条件设计的试验方法。该方法可以从横向与纵向的二维角度同时将含样品的双水相体系的3 个影响因素（上相、下相、样品）在其成相临界点附近由点及面直接进行比较优化，并消除两相及样品在成相时的相互作用和干扰所产生的体系变量误差，同时大大降低体系的试剂及原料用量成本，具有快速简便、经济适用的特点。

本研究采用该方法设计优化双水相萃取体系，分别从鲍鱼内脏、扇贝内脏、生蚝内脏3 种海洋生物的内脏中分离提取目标酶β-葡萄糖苷酶，分别探究三者的酶活性和萃取效果，以期为未来分离提取和分析海洋生物内脏活性物质的研究提供一个新的方法和思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲍鱼内脏（皱纹盘鲍）、扇贝内脏、生蚝内脏-80 ℃下冷冻储藏待用；对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，p-NPG）、β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，β-GC）活性检测试剂盒：北京索莱宝科技有限公司；对硝基苯酚、碳酸钠、磷酸二氢钠（NaH2PO4）、柠檬酸、乙酸、乙酸钠、氢氧化钠（均为分析纯）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）600、1000、1500、2000、4000：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

均质乳化机（A25S）：上海欧河机械设备有限公司；高速冷冻离心机（3-18K）：德国sigma 公司；制冰机（AF100）：意大利斯科茨曼制冰系统有限公司；酶标仪（Epoch 2）：美国伯腾仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理

本研究以鲍鱼内脏为原料，以酶比活为评价参数，探究双水相萃取目标酶（β-葡萄糖苷酶）的最优双水相体系条件，以解释并验证“52×3 双水相试验法”的可行性、简便性与实用性。

取一定质量的鲍鱼内脏，以1∶4 的质量比加入预冷的乙酸-乙酸钠缓冲液（0.1 mol/L pH4.5）[17]，在冰浴中用组织捣碎机匀浆后，冰浴浸提1 h 后，用高速冷冻离心机离心（10 000 r/min，4 ℃，15 min），取上清液（粗酶液）待用。

1.3.2 基础相图的制作

确定成相的两物质[5]为PEG600（PEG1000、PEG 1500、PEG2000、PEG4000）和NaH2PO4，分别配制成40%（质量分数）的浓溶液，备用。采用浊点法，在4 ℃环境下制作两物质的相图，绘制双节线。

1.3.3 最优双水相临界体系的测定

以PEG600（PEG1000、PEG1500、PEG2000、PEG4000）/NaH2PO4体系与鲍鱼内脏粗酶液为原料，利用“52×3双水相试验法”进行优化试验，分别制作“52”表和“3”点图，以下相酶比活为指标，探索从鲍鱼内脏、扇贝内脏、生蚝内脏中萃取β-葡萄糖苷酶的最优双水相体系及其对应的酶活力与萃取效果。

1.4 β-葡萄糖苷酶酶相关参数计算

β-葡萄糖苷酶（β-GC）活性检测试剂盒：采用p-NPG 比色法，在400 nm 处的吸光值来测定β-葡萄糖苷酶的酶活，酶活定义：每mg 组织蛋白每小时产生1 nmol对硝基苯酚定义为一个酶活力单位（U），标准曲线公式为y=0.002 9x+0.001 9，R2=0.999 1；采用Bradford 法，在595 nm 处的吸光值来测定蛋白含量，标准曲线公式为y=0.035 2x+0.559 5，R2=0.991 3；萃取目标酶以下（盐）相为主，计算公式如下。

式中：A 为酶比活，U/mg；U 为酶活，U/mL；P 为蛋白浓度，mg/mL；n 为纯化倍数；A下为下相酶比活，U/mg；A样为样品酶比活，U/mg；η 为萃取率，%；U下为下相总酶活，U/mL；V下为下相总体积，mL；U样为样品总酶活，U/mL；V样为样品总体积，mL。

1.5 52×3 双水相试验法说明

1.5.1 “52”成相临界点的测定

“52×3 双水相试验法”中的“52”点，即以相图的双节线为基础，选取中心位置的PEG（纵轴）5 个相邻的临界成相点为起点，分别固定每个点的PEG 质量分数，按固定比例增加盐（横轴）的质量分数，选取5 个点分别进行试验。

根据上述双水相相图为参考，称取一定质量的40% PEG600（1000、1500、2000、4000）原液和NaH2PO4加入15 mL 的刻度离心管中，加入一定质量的粗酶液后，加水补至体系总质量为10 g，充分摇匀至无固体沉淀后静置10 min，4 ℃下3 000 r/min 离心5 min，若体系分相，则记录上下相体积；若体系未分相，则NaH2PO4加入量增加2%，重新配制体系；成相后，继续分别增加两相的质量分数，各配制5 个不同质量分数组成的体系进行酶比活测定。

1.5.2 “3”点对比与验证

从上述“52”成相临界点试验中补充选取每个比活最高点（横轴）的左右两点，共3 点进行验证性试验，如三点从左到右，第一点或第二点为最优，则可确定该体系中的最优点；若第三点最优，则需按一定间隔继续增加盐的质量分数，至稳定的第一点则为最优点。

1.5.3 最优双水相临界体系对比与验证

对上述“52×3 双水相试验法”选取出的5 个不同PEG 分子量大小的最优点同时进行试验比较，即可得成相临界点最优双水相体系PEG/盐的种类与质量组成。以此方法，通过改变体系的组成条件（不同分子量的PEG、不同质量分数组成的PEG 及盐、不同的粗酶液加入量），可进一步探究不同条件影响下双水相体系的最优构成条件及规律。

1.6 数据处理

试验数据通过Excel 进行整理和计算，使用Origin（2021）软件进行数据可视化分析及作图。

2 结果与分析

2.1 PEG/NaH2PO4 双水相体系总相图的绘制

分别绘制PEG600、PEG1000、PEG1500、PEG2000、PEG4000 在4 ℃环境下的双水相相图，合并后如图1所示。

图1 PEG/ NaH2PO4 双水相相图Fig.1 Phase diagram of PEG/ NaH2PO4 aqueous two-phase system

相图的双节线上方是两相起始分相区，该区域作为选取不同PEG 种类及PEG 和NaH2PO4质量分数变量的参考基线。

2.2 “52×3”成相临界最优体系

在图1 中PEG600 双节线临界点附近选取质量分数2%间隔相邻的“5”个点，以及质量分数间隔2%的NaH2PO4的“5”个点，1 mL 粗酶液，补水至10 g 总体系，进行3 次平行试验，测定成相体系下相酶比活，结果如表1 所示。

表1 PEG600/NaH2PO4 双水相成相临界萃取体系Table 1 Critical extraction of PEG600/NaH2PO4 aqueous twophase system

由表1 可见，最优体系出现在成相临界点附近，从表中结果选取最优体系点，进行“3”点验证，即PEG600 质量分数不变（PEG 质量分数最小变量取2%为最优，再缩小容易不成相或体系不稳定），将NaH2PO4的质量分数取值范围间隔缩小至最优点（星号点）的加减“1%”，重复3 次试验，若最高点为由左到右的第一点或第二点，证明该点体系为最优；若最高点出现在第三点，则需以该点为中心点，再次进行左右的“3”点验证，排除误差，直至最高点出现在第一点或第二点，最终确定萃取临界点最优双水相体系，结果如图2 所示。

图2 PEG600/ NaH2PO4 三点验证图Fig.2 PEG600/ NaH2PO4 three-point verification diagram

根据上述“52×3 双水相试验法”测定PEG1000/NaH2PO4双水相萃取粗酶液的成相临界最优体系，结果如表2 和图3 所示。

表2 PEG1000/NaH2PO4 双水相成相临界萃取体系Table 2 Critical extraction of PEG1000/NaH2PO4 aqueous twophase system

图3 PEG1000/ NaH2PO4 三点验证图Fig.3 PEG1000/NaH2PO4 three-point verification diagram

根据上述“52×3 双水相试验法”继续测定PEG1500/NaH2PO4双水相萃取粗酶液的成相临界最优体系，结果如表3 和图4 所示。

表3 PEG1500/NaH2PO4 双水相成相临界萃取体系Table 3 Critical extraction of PEG1500/NaH2PO4 aqueous twophase system

图4 PEG1500/NaH2PO4 三点验证图Fig.4 PEG1500/NaH2PO4 three-point verification diagram

根据上述“52×3 双水相试验法”继续测定PEG2000/NaH2PO4双水相萃取粗酶液的成相临界最优体系，结果如表4 和图5 所示。

表4 PEG2000/NaH2PO4 双水相成相临界萃取体系Table 4 Critical extraction of PEG2000/NaH2PO4 aqueous twophase system

图5 PEG2000/NaH2PO4 三点验证图Fig.5 PEG2000/NaH2PO4 three-point verification diagram

根据上述“52×3 双水相试验法”继续测定PEG4000/NaH2PO4双水相萃取粗酶液的成相临界最优体系，结果如表5 和图6 所示。

表5 PEG4000/NaH2PO4 双水相成相临界萃取体系Table 5 Critical extraction of PEG4000/NaH2PO4 aqueous twophase system

图6 PEG4000/NaH2PO4 三点验证图Fig.6 PEG4000/NaH2PO4 three-point verification diagram

采用“52×3 双水相试验法”在不同PEG 分子量的双水相体系中，可以各做出一个“52”体系表和一个“3”点图。从以上图表中可以发现，每种PEG 分子量体系对目标酶萃取效果最优的组成比例，均出现在双水相成相临界点附近，且由于加入的样品中含有第3 种成分（乙酸-乙酸钠），导致双水相的成相临界点与原始相图相比，发生了一定程度的偏移。从“52”体系表可以看出，随着盐的质量分数的增加，体系萃取能力总体上表现为逐渐下降或先增后降的趋势，且随着PEG 分子质量的增加，最优体系会偏离成相临界点更多，萃取效果更好；从“3”点图可以看出随着PEG 质量分数的增加，体系萃取能力总体上表现为逐渐下降的趋势。

2.3 最优双水相临界体系的对比与应用

分别选取5 个PEG 体系中的最优体系（Ⅰ：12% PEG600/21% NaH2PO4；Ⅱ：10% PEG1000/20% NaH2PO4；Ⅲ：12% PEG1500/17% NaH2PO4；Ⅳ：10% PEG2000/18% NaH2PO4；Ⅴ：12% PEG4000/15% NaH2PO4），以鲍鱼内脏、扇贝内脏、生蚝内脏为原料，同时进行下相萃取物总酶活力的比较验证，结果见图7。

图7 各分子量PEG 最优双水相临界体系下相萃取目标酶总活力Fig.7 The total activity of PEG with different molecular weight optimal aqueous two-phase critical system on extraction of target enzymes

由图7 可知，最优双水相临界体系为Ⅴ：12% PEG4000/15% NaH2PO4，其下相萃取的总酶活、酶比活、纯化倍数、酶活回收率如表6 所示。

表6 最优双水相临界萃取体系萃取目标酶的结果Table 6 systemThe results of extracting target enzymes by the optimal aqueous two-phase critical extraction system

由表6 可知，对目标酶的萃取效果上，生蚝内脏＞鲍鱼内脏＞扇贝内脏。5 种PEG 分子量分别形成的最优双水相临界萃取体系中，PEG4000/NaH2PO4的临界体系对3 种海洋生物内脏中的β-葡萄糖苷酶萃取效果最好。双水相体系对β-葡萄糖苷酶的萃取效果与PEG 相分子量大小呈正相关性。当PEG 分子量比较小时，体系萃取效果不佳，目标酶集中在PEG 相，无法萃入盐相，因此下相收集效果差；随着PEG 分子量的增加，进入盐相的目标酶逐渐增加，其原因可能是随着PEG 分子量增加，疏水性增大，成相时所分配到的水减少，目标酶随着水相进入盐相，同时，粗酶液预处理液乙酸-乙酸钠缓冲液与盐相均呈酸性，在双水相体系中会影响体系的pH 值，进而影响蛋白质分子的电离度，成相临界点偏移，最终会影响被分离物质在双水相体系中分配活动，促使目标酶富集于盐相，大量杂蛋白和细胞碎片则停留在PEG 相和双水相分界层。此外，从图7 中还可以发现，3 种海洋生物内脏中均含有丰富的β-葡萄糖苷酶，其中，生蚝内脏下相萃取物中总酶活最高，但考虑到鲍鱼内脏无法食用，取材丰富且成本极低，以变废为宝的角度来看更加有研究价值。

3 结论

双水相萃取技术能温和高效的从样本中分离提取β-葡萄糖苷酶，且保留酶的较高活性和纯化率。本研究采用的“52×3 双水相试验法”不再仅以常规的双水相相图为依据，而是直接在试验中探究加入样品后的双水相成相临界规律，同时以双因素（PEG/盐）试验快速确定双水相体系临界点最优的PEG 种类、PEG 质量分数及盐质量分数，有效解决了各因素之间相互作用而产生的变量误差，快速且准确的构建针对试验样品的最优双水相萃取体系。同时，本研究通过对3 种海洋生物内脏样本的双水相临界萃取试验验证了“52×3 双水相试验法”的普遍适用性和应用性，为后续优化海洋生物酶的提取纯化方法提供新的试验思路和研究基础。