酶解果胶制备寡聚半乳糖醛酸及其对浆果类果实成熟软化的影响

胡倩，陈宁博，张乐乐，王延圣，杨莹，路来风*

（1.天津市食品质量与健康重点实验室，天津科技大学食品科学与工程学院，天津 300457；2.山东省农业科学院农产品加工与营养研究所，农业农村部新食品资源加工重点实验室，山东省农产品精深加工技术重点实验室，山东 济南 250100）

果实软化是成熟的重要标志，是一个复杂的细胞壁水解膨胀过程，包括果胶的水解及溶解、半纤维素和纤维素的解聚等[1-2]。果胶的降解是果实软化过程中最显著的变化，伴随着细胞壁中胶层的溶解，大量细胞壁结构丧失以及细胞壁物质降解，导致细胞发生分离，果实软化加剧[3-4]。成熟果品的适度软化可以显著提升其风味与口感，有助于增加果实的可食性，但不利于果实采后的运输、贮藏与销售。成熟软化将削减果实在采后流通、贮藏与销售过程中抵御机械损伤和病原微生物侵害的能力[5]。果实软化会增加果实损伤风险，果实损伤后呼吸强度和乙烯释放量增加，致使果实中的营养物质消耗加速、商品品质衰减；同时，为病原微生物提供侵染的直接入口，造成腐烂，果实软化与果实损伤两者闭环会加重生鲜果品损耗[6-7]。因此，如何控制果实采后软化过程，成为减少果实机械损伤以及病理性腐烂的关键问题。

目前，控制果实软化的主要措施包括：选择合适的采前栽培方式和矿物质元素（钙、磷、钾等）补充剂、控制采收期与采后环境温度、应用抗软化保鲜剂[1-甲基环丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）]与可食涂膜等[8-9]。本课题组前期研究表明，特定组合条件下用果胶酶酶解产物，可较好地抑制番茄等果实的采后软化和可溶性固形物产生过程；同时，促进番茄果实机械损伤愈合，愈合时间由原有自然状态下的24 h 缩短至12 h 以内，且12 h 时的灰霉病发病率降低至0%[10-13]。寡聚半乳糖醛酸（oligogalacturonides，OGs）作为损伤相关模式分子（damage associated molecular patterns，DAMPs）激活植物免疫[14-15]，同时作为果实软化过程中细胞壁的主要降解产物，对其生物学活性进行研究可以更好地解决果实生长发育及采后过度软化等系列品质劣变问题。

为明确OGs 自身化学特性对减缓浆果果实软化效果的影响及其减缓果实软化的分子机制，本文拟以易腐烂、难贮藏的红番茄果实为试验对象，选取果胶酶酶解不同来源果胶制备OGs，评价不同来源OGs 对番茄果实硬度的影响；结合高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）以及RNA 定量逆转录-聚合酶链式反应（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR） 技术研究OGs 与果实软化关联机制，并以红提葡萄、蓝莓、草莓等大宗浆果进行应用测试，以期为浆果果实成熟软化及其所衍生的采后品质劣变防治挖掘新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苹果渣、青番茄、柑橘皮、甜菜渣、红番茄、蓝莓、红提葡萄、草莓：市售，果实新鲜无伤，大小均匀一致。

果胶酶（30 000 U/g）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；RNAiso Plus、PrimeScrieptTMRT Master Mix（Takara）、TB Green R Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）：宝日医生物技术（北京）有限公司；无水乙醇、异丙醇、氯仿（均为色谱纯）：天津康科德生物有限公司；无水乙醇（分析纯）：上海麦克林生化科技股份有限公司；磷酸氢二钠、柠檬酸、高甲酯果胶、低甲酯果胶（均为分析纯）：索莱宝生物科技有限公司；盐酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

UC-5830 超声波清洗器：美国Ameritech 公司；DGG-101-2B 电热鼓风干燥箱：天津市天宇实验仪器有限公司；RE-2000A 旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；FDU-2110 冷冻干燥机：东京理化机械株式会社；Aglient1200 高效液相色谱仪、MX3000P 实时荧光定量PCR 仪：美国安捷伦公司；RID-20A 高效液相色谱系统示差折光检测器：日本岛津公司；GY-4 硬度计：浙江艾德堡仪器有限公司；AP-55 数显折光仪：浙江艾锐普仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 热水浸提法提取不同来源果实细胞壁果胶

参考王文骏[16]的方法预处理果实组织，将果实组织（苹果渣、青番茄、红番茄、橘皮、甜菜渣）放入90 ℃去离子水中，煮沸5 min，使果胶酶失活，并适当去除其中的苦涩物质、色素等杂质。用6 层纱布挤干水分后于50 ℃电热鼓风干燥箱中干燥，干燥后研磨粉碎，密封保存备用。

采用超声辅助热酸法提取果胶[17]，取一定质量果实粉末于去离子水中（用0.5 mol/L HCl 调节pH 值至1.53）。搅拌至充分溶胀，80 ℃提取2 h，每间隔20 min超声处理5 min。体系温度降至室温后，12 000 r/min 离心30 min。果胶提取液与2 倍体积的95%乙醇溶液混匀，4 ℃冰箱冷藏2 h。9 000 r/min 离心30 min，保留下层沉淀，与95%乙醇溶液混合，充分混匀后9 000 r/min离心30 min，重复多次，直至形成几乎透明的凝胶状物质，于45 ℃电热鼓风干燥箱中烘干至恒重，即得到果胶。

1.3.2 OGs 及不同甲酯果胶的酶解制备工艺流程

参考Yang 等[11]的方法并稍作修改，将1.3.1 提取的果胶、高甲酯果胶和低甲酯果胶用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH4.0）配制成0.5%的溶液，超声（40 kHz）至果胶溶解无大块颗粒，沸水煮沸后静置冷却。将果胶酶用缓冲液溶解并稀释至1 000 U/mL，后将0.5%果胶溶液与酶液按3∶1（体积比）混合，磁力搅拌器50 ℃恒温浸提12 h。反应结束后，将酶解产物煮沸5 min，使酶失活，随后60 ℃旋转蒸发将寡糖浓缩至15 mL后冻干，即得到粗OGs 组分、高甲酯寡聚半乳糖醛酸（highmethoxyl-oligogalacturonides，HM-OGs） 和低甲酯寡聚半乳糖醛酸（lowmethoxyl-oligogalacturonides，LM-OGs）。

1.3.3 OGs 的高效液相色谱检测

参照冀丽凤[17]的方法，将样品用流动相配制成1 mg/mL 的溶液，各样品通过0.22 μm 水系滤膜并超声脱气后进行寡糖组分检测。色谱柱为UltrahydrogelTMColumn WAT011550（6 μm，7.8 mm×300 mm）串联UltrahydrogelTMWAT011525（6 μm，7.8 mm×300 mm），接保护柱UltrahydrogelTMDP WAT011570（6 μm，6 mm×40 mm）。柱温40 ℃；流动相为超纯水，使用前用0.22 μm 水洗滤膜抽滤，超声脱气；流速0.6 mL/min。

1.3.4 OGs 处理红番茄果实样品制备及果实硬度测定

用打孔器（经75%乙醇溶液消毒）在红番茄果实赤道板等距打3 个孔（直径5 mm，深2 mm），每孔分别加入30.0 μL OGs 溶液（10 mg/mL），对照组加入等量的无菌水。静置2 h 后，置于恒温（28 ℃）恒湿（相对湿度90%～95%）环境中贮藏。于不同时间用无菌刀片在孔周围取样，并通过液氮快速冷冻，贮藏在-80 ℃冰箱中，用于基因相对表达量的测定。

使用硬度计（探针直径3.5 mm）测定果实硬度，每颗果实测量赤道板3 个以上位置，每组测量8 个果实，试验重复3 次。

1.3.5 qRT-PCR 检测

番茄果实总RNA 提取及RNA 反转录参照Yang等[11]的方法进行。

选用CAC 作为内参基因，测定OGs 处理前后PL3、PG2、PL5 基因的相对表达量。实时荧光定量PCR 反应体系如下：10 μL TB Green Premix Ex Taqll（Tli RNaseH Plus）（2×），0.8 μL PCR Forward Primer（10 μmol/L），0.8 μL PCR Reverse Primer（10 μmol/L），0.4 μL ROX Reference Dye or Dye ll（50×），2 μL RT 反应液（cDNA溶液），6 μL 无酶水，反应总体系为20 μL。反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，40 个循环，溶解曲线：95 ℃15 s，60 ℃30 s；95 ℃15 s。各基因引物如表1 所示。

表1 引物序列信息Table 1 Primer information

1.3.6 OGs 处理浆果果实及果实硬度、腐烂率、可溶性固形物含量测定

分别使用苹果渣果胶制得的OGs 溶液（10 mg/mL）浸泡蓝莓、红提葡萄、草莓10 min，室温晾干后，置于恒温（28 ℃）恒湿（相对湿度90%～95%）环境中贮藏。参照1.3.4 的方法于第3 天和第7 天测定果实硬度。

参考赵焕兰等[18]的方法，记录贮藏第3 天及第7天果实腐烂个数，腐烂率计算公式如下。

式中：R 为腐烂率，%；S 为腐烂果实总数；T 为果实总数。

参考张彪等[19]的方法，使用数显折光仪测定果实汁液中可溶性固形物含量。

1.4 数据处理与分析

用SPSS/PC ver.II.x（Statistical Product and Service Solutions）软件进行统计分析。当组内比较个数为3 个及3 个以上时，数据采用ANOVA 进行邓肯氏差异分析（取P<0.05）；组内个数为2 个时，采用独立样品t 检验进行平均数分离。每个单独的试验中每个处理至少设3 个以上重复，并按照完全随机区组原则进行设计。采用Origin 7.5 软件作图。

2 结果与分析

2.1 酶解不同来源果胶制得的OGs 对减缓红番茄果实软化的影响

以1 000 U/g 果胶酶酶解不同来源（苹果渣、青番茄、红番茄、橘皮、甜菜渣）果胶，考察制得的OGs 对红番茄果实软化的影响，结果如图1 所示。

图1 酶解不同来源果胶制得的OGs 对红番茄果实软化的影响Fig.1 Effect of OGs prepared by enzymatic hydrolysis of pectin from different sources on fruit softening of tomato

由图1 可知，与添加无菌水的对照组相比，OGs 诱导组减缓红番茄果实软化效果明显，不同来源果胶制得的OGs 抑制果实软化效果存在明显差异，橘皮来源OGs 软化效果最好，红番茄来源OGs 效果次之，分别是对照组硬度的1.68 倍和1.47 倍。考虑到苹果渣、青番茄、红番茄、橘皮及甜菜渣的单位质量果胶提取率为10.00%、1.00%、0.30%、2.00%和0.14%，从苹果渣中所提取果胶的得率远高于其他材料，后续选取苹果渣来源果胶开展试验。

对不同来源果胶制得的OGs 进行高效液相色谱测定，结果如图2 所示。

图2 酶解不同来源果胶获得的OGs 高效液相色谱图Fig.2 HPLC of OGs prepared by enzymatic hydrolysis of pectin from different sources

不同来源果胶经酶解所制得的不同聚合度的寡糖片段含量存在差异。本课题组前期利用柱分离结合质谱分析的研究结果表明，聚合度在2～5 之间的OGs具有较好的生物学效应[11，14]。由图2 可知，通过高效液相色谱检测，发现来源不同的果胶经酶解后OGs 中各组分分子量占比有所差异。不同来源（橘皮、苹果渣、红番茄、青番茄及甜菜渣）果胶制备的OGs 在14 min内组分的峰面积分别为5 941 899.3、4 967 682、4 687 725.5、3 834 910.5、835 302.2，进一步证明保留时间为14 min内的寡糖产物为OGs 的主要有效组分，该组分含量差异导致其减缓红番茄软化效果不同。

不同酯化程度果胶制备的OGs 处理红番茄果实后硬度，以及不同酯化程度果胶及所制备OGs 的高效液相色谱如图3 所示。

图3 不同酯化程度果胶制备的OGs 对果实软化的影响及高效液相色谱图Fig.3 Effect of OGs prepared by pectin with different esterification degrees on fruit softening and HPLC

果胶是主要由半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）分子链组成的多聚糖，缀以少量的鼠李糖分子及半乳糖醛酸、木聚糖和一些其他五碳糖组成的小侧链。其中，GalA 的羧基可以被甲酯化，而O-2 位、O-3位的羟基则可以被O-乙酰酯化，不同来源果胶的甲基化、乙酰化程度不同[16]。由图3A 可知，用HM-OGs 和LM-OGs 处理红番茄果实，两者均能显著减缓果实软化，但HM-OGs 处理组硬度比LM-OGs 处理组高0.83 N。

由图3B 可知，通过标准品建立标准曲线推算出保留时间在15.2 min 左右的产物为单糖。分别使用10 mg/mL的葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖诱导红番茄果实，4 种单糖诱导红番茄果实后硬度与对照组无显著性差异，排除了果胶组分中单糖差异对于红番茄果实硬度不同的影响。

2.2 OGs 诱导后红番茄果实细胞壁降解相关基因表达分析

OGs 诱导后红番茄果实细胞壁降解相关基因SlPL3、SlPG2、SlPL5 表达情况见图4。

图4 OGs 诱导后红番茄不同时间SlPL3、SlPG2、SlPL5 基因表达Fig.4 Effect of OGs induction on expression of SlPL3，SlPG2，and SlPL5 of tomato at different time

硬度是果实品质的重要性状，与果实质地和保质期相关。研究显示，番茄PL 与PG 基因家族的表达模式与果实硬度紧密相关。成熟红番茄果实中SlPG2a 基因的表达丰度占果皮总mRNA 的1%，沉默该基因表达能够抑制果实软化，是番茄中第一个商业化应用的“保鲜”基因[20]。反义PL 基因番茄果实的软化也会受到抑制，果实甲酯化的半乳糖醛酸聚糖（homogalacturonans，HGs）裂解减少，在不影响其他成熟品质指标的情况下，能够延长货架期[4]。如图4 所示，红番茄果实SlPG2、SlPL3 和SlPL5 的表达丰度在OGs 处理后受到抑制。OGs 处理后3 个基因的表达下调明显，在处理后第2、3、5 天SlPL3 基因相对表达量均低于对照组。红番茄SlPL5 基因相对表达量在OGs 处理后第1、2、5 天均低于对照组。红番茄SlPG2 基因相对表达量在OGs处理后第2、3、5 天均低于对照组。由此可知，OGs 处理后红番茄果实中3 种与果实软化密切相关的细胞壁降解基因表达受到抑制，可能延缓成熟番茄果实的软化进程。

2.3 OGs 诱导对浆果类果实软化的影响

OGs 诱导对浆果类果实硬度的影响如图5 所示。

图5 OGs 对3 种浆果果实硬度的影响Fig.5 Effect of OGs on firmness of three berries

由图5 可知，使用10 mg/mL OGs 分别浸泡红提葡萄、蓝莓、草莓3 种典型大宗浆果类果实。在贮藏期间，3 种浆果果实硬度整体呈下降趋势，果实贮藏至第7天时，OGs 处理组红提葡萄、蓝莓、草莓硬度分别高出对照组38.22%、37.48%、69.87%。OGs 处理可以很好地减缓贮藏期间果实的软化，维持果实硬度，很大程度上对果实起保护作用，以上结果也意味着OGs 的应用有利于改善果实采后的贮运过程中果实极易因机械损伤、微生物侵染等原因造成品质快速劣变的情况。OGs 诱导处理后红提葡萄、蓝莓、草莓3 种浆果类果实的软化均有所减缓，证明OGs 具有适用于减缓多种浆果类果实软化的潜力。

2.4 OGs 诱导对浆果类果实腐烂率、可溶性固形物的影响

OGs 诱导对浆果类果实腐烂率、可溶性固形物含量的影响见图6。

图6 OGs 对3 种浆果腐烂率和可溶性固形物含量的影响Fig.6 Effect of OGs on decay rate and soluble solid content ofthree berries

果实采摘及运输过程中，因机械损伤等原因造成果实表面的破损瘀伤以及瘀伤后严重软化的果实和受到病原菌侵染的果实均被视为损失果实，浆果类果实的高含水量与高营养价值，使其极易受到损伤，同时给微生物繁殖提供了很好的场所，果实的采后损伤也会直接导致果实的品质劣变[21-22]。由图6A、B、C 可知，在处理后第7 天OGs 处理组红提葡萄、蓝莓、草莓腐烂率分别较对照组降低了66.67%、63.61%、47.06%，经OGs 处理可以降低果实贮藏期间的腐烂率。

果实中的可溶性固形物包含组织中糖、酸、微量元素以及果实浆质等物质，通过折射系数反映[23]，可溶性固形物含量也能比较直观地反映出果实的品质，但在贮藏期间，可溶性固形物含量呈现出一种波动性。由图6D、E、F 可知，3 种浆果类果实在贮藏期间可溶性固形物含量整体呈上升趋势，其中红提葡萄、蓝莓组中OGs 处理组可溶性固形物含量高于对照组，而草莓组中OGs 处理组可溶性固形物含量较对照组降低。考虑可能是由果实种类差异、贮期间果实成熟度不一致、果实自身耐储性等原因造成的。

3 结论

本研究从不同来源果胶制得的OGs 影响果实软化的效果、影响果实软化的分子机制及在浆果果实上的应用3 个方面探究OGs 对浆果果实软化的影响。结果表明，造成不同来源果胶制得的OGs 减缓果实软化效果差异的主要原因是OGs 的聚合度，保留时间在14 min 以内的OGs 生物活性更高。OGs 通过抑制红番茄果实细胞壁降解相关基因SlPG2、SlPL3、SlPL5 的表达实现减缓成熟番茄果实软化的目的，且OGs 减缓果实软化的作用在蓝莓、草莓和红提葡萄中同样适用，表明OGs 可以有效抑制果实采后品质劣变。本文为研发和提升新鲜果蔬产品采后生理及病理劣变防治技术奠定基础，为果蔬保鲜提供技术新思路。