系统性红斑狼疮患者外周血中T细胞α7nAChR mRNA的表达及其临床意义

王思茹，杨娉婷

（中国医科大学 1. 附属盛京医院风湿免疫科，沈阳 110004； 2. 附属第一医院风湿免疫科，沈阳 110001）

系统性红斑狼疮 （systemic lupus erythematosus，SLE） 是以产生自身免疫性抗体以及免疫复合物为特点的慢性、炎症性自身免疫性疾病［1］。免疫复合物沉积激活了经典补体通路，导致了自身炎症和多系统的损伤。SLE病因比较复杂，目前其发病机制尚未完全阐明。已有研究［2］表明，免疫系统和神经系统共同调控炎症的发生和发展。近年来迷走神经介导的“胆碱抗炎通路”受到广泛关注［3］。作为免疫的核心细胞，T细胞表达大部分胆碱能系统的组成成分，包括胆碱乙酰转移酶、乙酰胆碱酯酶受体以及毒蕈碱型和烟碱型乙酰胆碱受体 （muscarinic acetylcholine receptors，mAChRs；nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs）。在乙酰胆碱酯酶受体中，免疫细胞表达mAChRs 5 个亚型 （M1～M5） 和nAChRs中的α2、α4、α5、α6、α7、 α9、α10 亚型［4］。

nAChRs广泛表达，是乙酰胆碱门控离子通道，具有不同的性质和功能［5］。在神经肌肉连接处和自主神经节中，nAChRs介导兴奋性突触传递；而在中枢神经系统神经元中，nAChRs主要起调节作用。nAChRs也在非兴奋性细胞中表达，影响细胞分化和增殖［6］。α7烟碱型乙酰胆碱受体 （α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAChR） 在非兴奋细胞中的作用体现在胆碱能抗炎途径中。免疫细胞中α7nAChR表达，通过迷走神经的传出神经抑制炎症［5］。在炎症发展过程中，外周细胞因子激活迷走神经的传入纤维，使迷走神经远端释放乙酰胆碱；乙酰胆碱激活α7nAChR，进而参与调节机体炎症反应［7］。

FUJII等［8］研究提示T细胞表面α7nAChR参与慢性炎症的免疫调节及 辅助T细胞 （T helper cell，Th） 分化，α7nAChR与肾脏慢性炎症和肾脏损伤相关。SLE患者外周血中乙酰胆碱水平低且不稳定，乙酰胆碱受体表达水平也相对较低，因此，检测乙酰胆碱受体mRNA表达是目前常用的方法［8］。关于SLE患者外周血T细胞α7nAChRsmRNA水平的研究目前尚未见报道。本研究探讨SLE患者外周血中CD4+T细胞和CD8+T细胞α7nAChRmRNA的表达情况及临床意义，旨在为SLE的发病机制及治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选取2019 年 7 月至12 月中国医科大学附属第一医院风湿免疫科住院的16例女性SLE患者为SLE组。下载患者电子病历收集一般临床资料 （年龄、性别、病程和主要症状） 和实验室检测指标 ［血常规、尿常规、肝肾功能、24 h尿蛋白定量、红细胞沉降率 （erythrocyte sedimentation rate，ESR）、 C反应蛋白 （C-reactive protein，CRP）、免疫球蛋白 （IgA、IgG、IgM）、补体 （complement，C） 3、C4、细胞因子和T细胞亚群、SLE疾病活动指数 （systemic lupus erythematosus disaease activity index，SLEDAI） ］。

纳入标准：符合欧洲风湿病联盟 （EULAR） 和美国风湿病学会 （ACR） 的SLE分类标准［9］。排除标准：（1） 原发性肾脏疾病、肾血管畸形；（2） 糖尿病、心脑血管疾病、恶性肿瘤、脑梗死、病毒性肝炎、肝硬化、血液病及其他严重疾病；（3） 并发感染。选取 16 例年龄相匹配的女性健康志愿者作为对照组 （NC组）。本研究获得中国医科大学附属第一医院伦理委员会批准，患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 外周血单个核细胞 （peripheral blood mononuclear cell，PBMC） 分离

采集患者早晨空腹肘静脉血 （5 mL）。采用Ficoll-PaqueTMPLUS （美国Amersham Biosciences公司） 以梯度离心法从5 mL乙二胺四乙酸 （ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA） -新鲜抗凝全血中分离获得PBMC。

1.3 CD4+ T和CD8+ T细胞分选

以等体积磷酸盐缓冲液 （phosphate buffer saline，PBS） 重悬PBMC，PBS和PBMC按1 ∶1混合，共230g。 25 ℃下220g离心8 min，离心后取上清液，重复上述操作。然后使用人CD4 MicroBeads、人CD8 MicroBeads （德国Miltenyi Biotec公司）按照试剂说明书分选并获得CD4+T细胞和CD8+T细胞。

1.4 实时PCR （real time PCR，RT-PCR） 检测CD4+T细胞、CD8+ T细胞中α7nAChR mRNA表达

使用Axyprep™ Multisource Total RNA Miniprep Kit （#AP-MN-MS-RNA-50，美国Axygen公司） 试剂盒分别从CD4+T细胞、CD8+T细胞中提取RNA 。使用Primescript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser（#RR047A，大连TaKaRa公司） 试剂盒将RNA逆转录为cDNA。RT-PCR采用TB Green™ Premix EX Taq™Ⅱ （#RR820A，大连TaKaRa公司） 试剂盒，引物系列：α7nAChR，正向5’-CCGACGGGGGCAAGATGC-3；反向5’-GGCCGCGGAAGCCGATGTAC-3’。GAPDH，正向5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAACC-3；反向5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。

实验前对引物进行PCR验证，1.5%琼脂糖凝胶电泳可以得到扩增后的单一片段。RT-PCR反应体系为20 μL，TB Green qPCR Master Mix 12.5 μL，正向、反向引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 3.5 μL。扩增条件：95 ℃预变性3 min，然后95 ℃溶解15 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共39个循环。采用2-ΔΔCt计算基因相对表达量。

1.5 统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料采用±s表示；偏态分布的计量资料采用M（P25～P75） 表示，对数转化后数据符合正态分布。2组间CD4+T细胞和 CD8+T细胞α7nAchRmRNA表达比较采用独立样本t检验。α7nAchRmRNA表达与各临床指标的关系采用Pearson或Spearman相关分析。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

SLE组年龄 （33.42±14.60） 岁，NC组年龄 （25.33±5.66） 岁，2组比较差异无统计学意义 （P＞ 0.05）。SLE组患者各项临床指标见表1。

表1 SLE组患者各项临床指标Tab.1 Clinical indicators in the SLE group

2.1 2组外周血中CD4+T细胞和CD8+T细胞α7nAChR mRNA的表达比较

结果显示，SLE组患者外周血中CD4+T细胞和CD8+T细胞α7nAChRmRNA表达分别为0.50±0.27、0.83±0.58；NC组CD4+T细胞和CD8+T细胞α7nAChRmRNA表达分别为1.02±0.49、1.83±0.46，SLE组均显著低于NC组 （P分别为0.005、0.001）。

2.2 SLE患者外周血中CD4+ T细胞和CD8+ T细胞α7nAChR mRNA的表达与各项临床指标的相关分析

结果显示，SLE患者CD4+T细胞α7nAChRmRNA表达与SLEDAI （r= -0.605，P= 0.03） 血清IgG （r=-0.637，P= 0.035） 和CRP （r= -0.611，P= 0.034） 水平显著负相关。见表2。

表2 SLE患者CD4+ T细胞和 CD8+ T细胞α7nAChR mRNA水平与各项临床指标的相关分析结果Tab.2 Correlation analysis of α7nAChR mRNA levels in CD4+ and CD8+ T cells with various clinical indicators in patients with SLE

3 讨论

胆碱能抗炎途径是一种免疫反应调节机制，取决于自主神经系统，是由迷走神经、乙酰胆碱及其受体等组成的经典神经免疫调节通路，也称为抗炎反射［10］。胆碱能抗炎途径可激活调节免疫细胞，通过抑制细胞增殖分化和细胞因子释放发挥抗炎作用［11-12］。在败血症、结肠炎和心肌缺血性损伤模型中，增加副交感神经张力可以抑制细胞因子释放、减轻组织损伤并改善炎症介导的损伤［13］。

胆碱能神经元可以抑制急性炎症，迷走神经刺激在多种炎症介导疾病模型中具备有益作用［14］。胆碱能抗炎途径的核心成分是α7nAChR。研究［14］显示，在α7-/-小鼠分离的巨噬细胞中，尼古丁对肿瘤坏死因子-α （tumor necrosis factor alpha，TNF-α） 产生的抑制作用减弱。同样，迷走神经刺激降低血清TNF-α水平。

既往研究［15］阐明a7nAChR对T细胞和抗原呈递细胞 （antigen-presenting cells，APCs） 具有特异性功能，a7nAChR通过抑制抗原加工而干扰抗原递呈，从而抑制CD4+T细胞活化；CD4+T细胞a7nAChR促进Treg和效应T细胞的发育。a7nAChR对APCs和T细胞的不同功能可能与免疫应答强度的调节有关［16］。核因子κB （nuclear factor κB，NF-κB） 是炎症反应中不可代替的关键性转录因子，NF-κB可与多种调控基因的启动子结合并活化，调控炎症反应相关基因的转录，促进大量炎性细胞因子的表达［17-18］。CHRNA7是α7nAChR的编码基因，大量表达于免疫细胞及线粒体表面［19］。α7nAChR与乙酰胆碱特异性结合后可激活下游信号因子，抑制NF-κB信号通路激活，使炎症介质合成下调来发挥抗炎作用［20］。

既往研究［21］证实了脾胆碱能信号在促进自身反应性B细胞生成和SLE发生发展中起重要作用。通过中和乙酰胆碱能递质或拮抗胆碱能受体来抑制胆碱能信号传导可能是使体内B细胞代谢正常化的机制，并可作为SLE患者的治疗药物靶点。FAIRLEY等［22］研究发现SLE狼疮小鼠胆碱抗炎通路受到抑制，刺激胆碱抗炎通路可以使炎症反应减弱，从而保护肾脏。此外，SLE部分患者还会表现自主神经病变［22］，这些均提示迷走神经低活性和胆碱抗炎通路受损参与了SLE的发生和发展。

已有研究［22-23］表明，免疫T细胞表面高度表达乙酰胆碱受体，其中α7nAChR受体与胆碱抗炎通路显著相关；研究还发现尼古丁体外作用于α7 缺陷小鼠的CD4+T细胞，能抑制CD4+T细胞对外来抗原的应答，下调T细胞的自身增殖，降低Th1 细胞的免疫应答，从而下调TNF-α和INF-γ的表达，并降低Th17细胞的免疫应答，下调IL-17、 IL-21、 IL-22 分泌，从而提升胆碱抗炎通路的活性。提示α7nAChR参与免疫调节，α7nAChR拮抗剂 （尼古丁等） 有望成为免疫系统疾病的有效治疗靶点。本研究结果显示，SLE组外周血CD4+T细胞和CD8+T细胞α7nAChRmRNA表达较NC组显著降低 （均P＜ 0.05）。SLE患者外周血CD4+T细胞α7nAChRmRNA表达与SLEDAI、血清IgG和CRP水平呈显著负相关 （均P＜ 0.05）。提示SLE患者外周血中CD4+T细胞表面α7nAChR可能参与了SLE的发生发展，因此α7nAChR可以作为判定SLE疾病活动的临床新指标，与以往研究结果一致。

综上所述，SLE患者外周血CD4+T细胞及CD8+T细胞表面α7nAChRmRNA与正常人相比显著降低，其水平与SLEDAI、IgG、CRP水平显著负相关。本研究为进一步明确 SLE发病中的具体机制及临床工作中病情活动评价提供了依据。今后将进一步扩大样本量，同时按照器官受累情况进一步分组，深入探讨α7nAChRmRNA表达在SLE患者中的临床意义。