慢性心力衰竭患者血浆外泌体LncRNA H19、miR-214表达与炎性因子和左心室重构的关系

苏布道,梁戎,灵小,苏日娜

慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)是临床常见的一种由心脏结构或功能异常导致的射血功能受损或心室充盈的临床综合征,近年来随着人口老龄化的持续发展和各种心血管疾病患者生存期的延长,CHF发生率逐年上升,给我国造成了巨大的公共卫生负担[1-3]。左心室重构(left ventricular remodeling,LVR)是心力衰竭发生发展的病理基础,炎性反应在LVR中发挥重要作用[4-5]。寻找可反映CHF炎性反应和LVR的生物标志物对改善患者预后至关重要。研究表明,外泌体非编码RNA能通过调控炎性反应和LVR等参与心力衰竭发生发展[6]。长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)H19是最先被发现的LncRNA之一,LncRNA H19能促进心肌细胞炎性反应[7]。微小RNA(microRNA,miRNA)-214是一种广泛保守的miRNA,研究报道miR-214能抑制心肌细胞炎性反应[8]。现分析CHF患者血浆外泌体LncRNA H19、miR-214表达与炎性因子和左心室重构的关系,报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2020年7月—2022年9月内蒙古自治区人民医院心血管内科收治CHF患者120例为CHF组,其中男46例,女74例,年龄43～87(60.93±9.03)岁;病程3～17(10.54±2.64)年;纽约心脏病协会(New York Heart Association,NYHA)心功能分级[9]:Ⅱ级44例,Ⅲ级40例,Ⅳ级36例;诱发疾病:冠心病54例,扩张型心肌病21例,原发性高血压45例;合并症:慢性肾脏病14例,慢性阻塞性肺疾病11例,糖尿病9例,中枢性睡眠呼吸暂停16例。另选取同期医院体检健康志愿者40例为健康对照组,其中男15例,女25例,年龄39～76(61.52±8.44)岁。2组性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究已经获得医院伦理委员会批准(2020-02-0321),受试者及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准:①符合《慢性心力衰竭基层诊疗指南(2019年)》[10]中CHF诊断标准;②年龄≥18岁。(2)排除标准:①急性心力衰竭;②先天性心脏疾病;③妊娠及哺乳期妇女;④造血、免疫、神经系统损害;⑤合并严重肝肾功能不全、恶性肿瘤。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 血浆外泌体LncRNA H19、miR-214基因表达检测:使用枸橼酸钠采血管收集受试人员空腹静脉血3 ml,离心留取血浆置于离心管,再次离心收集上清液保存于离心管,放置于-80℃冰箱冻存。室温下解冻血浆取1 ml至离心管,经缓冲液XBP、XWP、XE 350加入和离心后,孵育再离心收集洗脱液。透射电子显微镜(日立高新技术公司,型号:HT7800)观察分离所得血浆外泌体(直径为30～150 nm类圆形双层膜囊泡)。取血浆外泌体200 μl,Trizol试剂盒(赛默飞世尔科技公司)提取血清总RNA,鉴定纯度、浓度合格后,Takara反转录试剂盒(北京智杰方远科技有限公司)合成cDNA,反应条件:37℃ 1 h、80℃ 5 s。按照SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)进行实时荧光定量聚合酶链式反应,反应体系共20 μl:cDNA 1 μl、上下游引物各0.5 μl、Universal miRNA qPCR primer 0.5 μl、2×TransStart®Top Green qPCR SurperMix 10 μl、无核酸酶水7.5 μl;反应条件:95℃ 90 s(1次),95℃ 30 s、63℃ 30 s、72℃ 15 s(循环40次)。LncRNA H19以GAPDH为内参,miR-214以U6为内参,2-ΔΔCT法计算血浆外泌体LncRNA H19、miR-214相对表达量。LncRNA H19正向引物:5′-TCCCAGAACCCACAACATGAA-3′,反向引物:5′-TTCACCTTCCAGAGCCGATTC-3′;GAPDH正向引物:5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′,反向引物:5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′;miR-214正向引物:5′-CGTGTGCAAATCCATGCAA-3′,反向引物:5′-CGTGTGCAAATCCATGCAA-3′;U6正向引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向引物:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3.2 血清炎性因子检测:患者入院翌日晨和健康对照组体检时采集空腹肘静脉血3 ml,离心留取上层血清,采用酶联免疫吸附法(武汉纯度生物科技有限公司)检测白介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、IL-18、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。

1.3.3 超声心动图检查:研究对象均采用M型彩色多普勒超声诊断仪(荷兰飞利浦,型号:EPIQ7)行超声心动图检查,参考《超声心动图评估心脏收缩和舒张功能临床应用指南》[11]通过双平面法(改良Simpson)检测左心室舒张末期内径(left ventricular end diastolic diameter,LVEDD)、左心室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness, LVPWT)、舒张末期室间隔厚度(interventricular septal thickness,IVST),使用体表面积校正左心室质量计算左心室心肌质量指数(left ventricular myocardial mass index, LVMI)。

2 结 果

2.1 2组血浆外泌体LncRNA H19、miR-214表达比较 CHF组血浆外泌体LncRNA H19表达高于健康对照组,miR-214表达低于健康对照组(P<0.01),见表1。

表1 健康对照组与CHF组血浆外泌体LncRNA H19、miR-214表达比较

2.2 不同NYHA心功能分级CHF患者血浆外泌体LncRNA H19、miR-214表达比较 NYHA心功能分级Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级CHF患者血浆外泌体LncRNA H19表达依次升高,miR-214表达依次降低(P<0.01),见表2。

表2 不同NYHA心功能分级CHF患者血浆外泌体LncRNA H19、miR-214表达比较

2.3 2组血清炎性因子和左心室重构指标比较 CHF组血清IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平高于健康对照组(P<0.01),见表3。CHF组LVEDD、LVPWT、IVST、LVMI高于健康对照组(P<0.01),见表4。

表3 健康对照组与CHF组血清炎性因子水平比较

表4 健康对照组与CHF组左心室重构指标比较

2.4 不同NYHA心功能分级CHF患者血清炎性因子和左心室重构指标比较 NYHA心功能分级Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级CHF患者血清IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平依次升高(P<0.01),见表5。NYHA心功能分级Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级CHF患者LVEDD、LVPWT、IVST、LVMI依次升高(P<0.01),见表6。

表5 不同NYHA心功能分级CHF患者血清炎性因子水平比较

表6 不同NYHA心功能分级CHF患者左心室重构指标比较

2.5 CHF患者血浆外泌体LncRNA H19、miR-214表达与炎性因子、NYHA心功能分级和左心室重构指标的相关性 经StarBase数据库https://starbase.sysu.edu.cn/预测,LncRNA H19与miR-214存在互补序列,见图1。Pearson/Spearman相关性分析显示,CHF患者血浆外泌体LncRNA H19与IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α、NYHA心功能分级、LVEDD、LVPWT、IVST、LVMI呈正相关,与miR-214呈负相关(P<0.01);miR-214与IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α、NYHA心功能分级、LVEDD、LVPWT、IVST、LVMI呈负相关(P<0.01),见表7。

图1 LncRNA H19与miR-214互补序列示意图

表7 CHF患者血浆外泌体LncRNA H19、miR-214表达与NYHA心功能分级、炎性因子和左心室重构指标的相关性

2.6 血浆外泌体LncRNA H19、miR-214预测CHF患者发生左心室重构的效能 绘制血浆LncRNA H19、miR-214预测CHF患者发生左心室重构的ROC曲线,并计算AUC。结果显示,血浆外泌体LncRNA H19、miR-214及二者联合预测左心室重构的AUC分别为0.780、0.779、0.877,二者联合的AUC高于单项预测(Z=3.026、3.114,P=0.003、0.002),见表8、图2。

图2 LncRNA H19、miR-214预测CHF患者发生左心室重构的ROC曲线

表8 LncRNA H19、miR-214预测CHF患者发生左心室重构的效能比较

3 讨 论

CHF是所有心血管疾病的必然终点,主要因原发性心肌损害和异常引起,尽管近年来在其预防、诊疗和综合管理等领域取得较大进展,心脏再同步治疗等治疗技术和“新四联”药物被应用于CHF治疗,但CHF再住院率和病死率仍然居高不下[12-13]。目前临床已普遍使用B型钠尿肽或N末端B型利钠肽前体诊断CHF和评估其病情、预后,但二者易受到性别、年龄、肥胖、肾功能、药物、贫血等多种因素影响[14],还需寻找新的生物标志物。

左心室重构是CHF发生发展和决定病情、预后的病理基础,其过程涉及炎性反应、氧化应激、细胞凋亡、细胞纤维化等诸多机制,炎性反应能通过促进心肌细胞凋亡促进左心室重构[4-5]。IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α是临床常用的炎性因子指标。目前临床主要通过超声心动图评估左心室重构,左心室重构后表现为LVEDD、LVPWT、IVST、LVMI升高[4,11]。本研究结果显示,与健康对照组比较,CHF组血清IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平和LVEDD、LVPWT、IVST、LVMI升高,说明CHF患者存在明显的炎性反应和左心室重构,符合CHF患者病理变化。结果还显示,NYHA心功能分级Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级CHF患者血清IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平和LVEDD、LVPWT、IVST、LVMI依次升高,说明CHF患者随着病情加重,炎性反应和左心室重构会进一步加重。

外泌体是来源于多种细胞的一种直径30～150 nm的囊泡,能通过运载脂质、蛋白质、非编码RNA等物质传递细胞和组织间的信息,其内携带的多种遗传物质能通过自分泌和旁分泌途径被细胞、组织、器官吸收,参与多种病理生理过程[15]。近年研究表明,非编码RNA能通过调控炎性反应、氧化应激、细胞凋亡、细胞纤维化等诸多机制参与左心室重构过程[16]。LncRNA H19是最早被证实的肿瘤相关LncRNA[17]。近年研究发现,LncRNA H19还参与其他疾病过程,Wang等[18]研究报道,LncRNA H19在心肌细胞代谢紊乱中发挥至关重要的作用,与心脏功能密切相关。Luo等[19]研究报道,敲低或抑制LncRNA H19能减少心肌细胞炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达,抑制心肌细胞缺血/再灌注后炎性反应和凋亡。Tang等[20]研究报道,抑制LncRNA H19能减少糖尿病大鼠心肌细胞炎性反应和凋亡,促进大鼠心功能改善。上述研究表明,LncRNA H19与心肌细胞炎性反应和凋亡密切相关。本研究结果显示,CHF患者血浆外泌体LncRNA H19表达上调,并随着NYHA心功能分级增加而上调,说明血浆外泌体LncRNA H19表达上调参与CHF发生发展。结果还显示,CHF患者血浆外泌体LncRNA H19与IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α、LVEDD、LVPWT、IVST、LVMI呈正相关,说明血浆外泌体LncRNA H19高表达与CHF炎性反应和左心室重构有关。最近Choong等[21]研究也报道,下调LncRNA H19能抑制小鼠心肌梗死后左心室重构。

miR-214是一种骨代谢关键调控的miRNA[22]。近年研究发现,miR-214还参与其他疾病过程,陈贻人等[23]研究报道,上调miR-214表达能抑制脂多糖诱导的IL-1β、IL-6、TNF-α、Bax表达,抑制心肌细胞炎性反应和凋亡。Lan等[24]研究报道,上调miR-214表达能抑制缺氧诱导的IL-1β、IL-6、TNF-α和丙二醛、超氧化物歧化酶表达,抑制心肌细胞炎性反应和氧化应激,改善心肌细胞损伤。上述研究表明,miR-214能通过抑制炎性反应改善心肌损伤。同时Gholaminejad等[25]通过基因集富集分析发现,miR-214在心力衰竭中差异表达,可能是心力衰竭新的标志物。本研究结果显示,CHF患者血浆外泌体miR-214表达下调,并随着NYHA心功能分级增加而下调,说明血浆外泌体miR-214表达下调参与CHF发生发展。结果还显示,CHF患者血浆外泌体miR-214与IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α、LVEDD、LVPWT、IVST、LVMI呈负相关,说明血浆外泌体miR-214低表达与CHF炎性反应和左心室重构有关。Du等[26]实验也报道,上调miR-214能抑制心肌梗死后左心室重构。

研究表明,LncRNA能通过海绵miRNA调控相关病理过程[27]。笔者通过StarBase数据库预测发现,LncRNA H19与miR-214存在互补序列,相关性分析也发现,LncRNA H19与miR-214在CHF患者血浆外泌体中表达呈负相关,提示LncRNA H19与miR-214可能共同通过炎性反应和左心室重构参与CHF过程。张苡榕等[28]研究也显示,沉默LncRNA H19能靶向上调miR-214,抑制心肌细胞炎性反应和凋亡,改善心肌损伤。最后本研究通过绘制ROC曲线分析外泌体LncRNA H19、miR-214表达对CHF患者发生左心室重构的效能发现,血浆LncRNA H19、miR-214及二者联合预测左心室重构的AUC分别为0.780、0.779、0.877,二项联合的AUC最大,这说明血浆外泌体LncRNA H19、miR-214可能成为CHF患者左心室重构的评估指标,且二者联合检测能提升其评估价值。

综上所述,CHF患者血浆外泌体LncRNA H19表达升高,miR-214表达降低,二者可能共同影响CHF患者病情严重程度、炎性反应和左心室重构。但本研究结果仍需多中心研究验证。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

苏布道:设计研究方案,收集整理数据,论文撰写;梁戎:提出研究思路,分析试验数据,论文审核;灵小:实施研究过程,资料搜集整理,论文修改;苏日娜:收集数据,进行统计学分析,论文修订