三甲胺N-氧化物与肺动脉高压的因果关系：两样本孟德尔随机化分析

曹溢，丰瑞谊，唐燕，罗强，张艺文，汪汉

肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一种进行性肺血管疾病，其临床特征是持续的肺血管收缩、肺血管重塑和原位血栓形成导致肺动脉顺应性降低和肺血管阻力增加，最终导致右心衰竭和死亡［1］。PAH的发病率和病死率均较高，估计每100万成年人中就有10.6人罹患PAH［2］。尽管目前PAH治疗方面有了新的进展，但尚缺乏有效药物，故其病死率仍居高不下［3］。因此，继续探讨可能参与PAH的其他病理生理学机制非常必要。研究表明，肠道菌群代谢产物三甲胺N-氧化物（trimethylamine N-oxide，TMAO）与PAH密切相关［4］，但具体因果关系尚未完全明确。孟德尔随机化方法是探索暴露因素与结局关系的一种流行病学方法［5］，其可克服观察性研究中的反向因果关系和潜在混杂因素的影响。本研究基于两样本孟德尔随机化分析，以TMAO为暴露因素、PAH为结局，探讨了TMAO与PAH的因果关系，以期为PAH的防治提供参考。

1 资料与方法

1.1 数据来源 TMAO的数据集来自全基因组关联分析（genome wide association study，GWAS），包括弗雷明翰心脏研究的2 076名欧洲参与者的人类代谢组的汇总数据［6］，详见https://academic.oup.com/nar/article/42/D1/D975/1061961。PAH的数据集来自芬兰数据库，包括162 962名欧洲受试者的16 380 163个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）信息，详见https://gwas.mrcieu.ac.uk/datasets/finn-b-I9_HYPTENSPUL/。

1.2 工具变量的选择 由于GWAS中很少有肠道菌群代谢产物的SNP达到全基因组显著性水平（P＜5×10-8），故本研究选择具有提示性全基因组显著性水平（P＜5×10-5）的SNP作为工具变量。工具变量的选择基于以下3个条件：（1）工具变量与TMAO显著相关；（2）工具变量与PAH无关；（3）仅有TMAO影响PAH。采用Plink软件提取备选SNP，备选SNP需满足以下条件：（1）P＜5×10-5；（2）连锁不平衡参数（r2）＜0.001；（3）设置区域宽度为10 000 kb，以保证各SNP之间相互独立。其次，利用catalog和PhenoScanner数据库进一步分析备选SNP是否与混杂因素相关，本研究仅纳入与混杂因素不相关的SNP。最后，采用F统计量判断SNP与TMAO的相关强度，以F统计量≤10为存在弱工具变量偏倚的可能性，剔除存在弱工具变量偏倚可能性的SNP。

1.3 孟德尔随机化分析方法

1.3.1 效应量估计 采用逆方差加权法（inversevariance weighting，IVW）评估TMAO与PAH之间的关系，如存在异质性则使用随机效应模型，否则使用固定效应模型。其次，使用MR-Egger回归、最大似然比（maximum likelihood，ML）、加权中位数（weighted median，WM）和MR多效性残差和与异常值（MR pleiotropy residual sum and outlier，MR-PRESSO）及MR稳健性评分（MR-robust adjusted profile score，MRRAPS）对IVW的结果进行补充［7］。

1.3.2 水平多效性和异质性检验 首先，使用MRPRESSO检测异常值，若存在异常值，则去除异常值后重新进行分析。然后进行留一法敏感性分析，其是每次排除单个SNP，对剩余SNP重新进行IVW分析，从而判断单个SNP对IVW结果的影响。其次，采用MR-Egger法的截距表示是否存在水平多效性，若截距的P值＜0.05则认为存在水平多效性。再者，采用Cochran'sQ检验分析工具变量的异质性；最后，采用漏斗图分析研究结果的潜在偏倚情况。

1.4 统计学方法 采用R软件中的TwoSampleMR包进行统计分析，所有结果以OR值及其95%CI表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 工具变量的选择 经筛选，与TMAO密切相关的工具变量共9个，分别是rs4846884、rs12131532、rs17131718、rs1538291、rs12116428、rs7522157、rs3935570、rs6656619及rs11583422。9个工具变量的F统计量均＞10，提示存在弱工具变量偏倚的可能性较小。

2.2 孟德尔随机化分析结果 IVW 分析结果显示，TMAO可能会增加PAH发生风险〔OR=1.777，95%CI（1.002，3.149），P=0.048〕；上述关系在ML〔OR=1.806，95%CI（1.004，3.251），P=0.049〕、MR-PRESSO〔OR=2.063，95%CI（1.165，3.652），P=0.037〕及MR-RAPS〔OR=2.063，95%CI（2.054，2.259），P=0.015〕中被证实，但在MR-Egger回归〔OR=1.394，95%CI（0.302，6.422），P=0.685〕和WM〔OR=1.919，95%CI（0.859，4.288），P=0.112〕中未被证实，见图1～2。

图1 主效应图Figure 1 Main effect diagram

图2 每个SNP对PAH影响的森林图Figure 2 Forest map of the effects of each SNP on PAH

2.3 水平多效性和异质性检验结果 MR-PRESSO分析结果显示，本研究纳入的SNP不存在异常值。留一法敏感性分析结果显示，逐一删除单个SNP后IVW分析结果无明显变化，见图3。MR-Egger法的截距分析结果显示，本研究不存在任何水平多效性（P=0.369）。Cochran'sQ检验结果显示，工具变量不存在异质性（P=0.586）。漏斗图分析结果显示，所有工具变量呈非对称性分布，表明该研究结果可能存在潜在偏倚，见图4。

图3 留一法敏感性分析结果Figure 3 The results of leave-one-out sensitivity analysis

图4 漏斗图Figure 4 Funnel plot

3 讨论

本研究基于两样本孟德尔随机化分析探讨了TMAO与PAH的因果关系，IVW分析结果显示，TMAO可能会增加PAH发生风险〔OR=1.777，95%CI（1.002，3.149）〕；上述关系在ML、MR-PRESSO及MR-RAPS中被证实，但在MR-Egger回归和WM中未被证实，考虑IVW分析的统计效应值最好，故认为该结果比较可靠，提示TMAO与PAH可能存在因果关系，TMAO每升高1个单位，PAH发生风险升高77.7%，故干预TMAO或产TMAO的肠道菌群可能对预防PAH具有积极作用。

本研究孟德尔随机化分析结果与既往临床研究结果一致，如MOUTSOGLOU等［8］研究表明，PAH患者肠道菌群失调，其中血液循环中短链脂肪酸和次级胆汁酸较低可能会促进PAH的发生。KIM等［9］通过宏基因组学分析比较了18名1型PAH患者〔平均肺动脉压为57.4 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）〕和13名对照者的粪便微生物组，结果显示，PAH患者微生物菌落的分类和功能发生了明显变化，与对照者相比，PAH患者精氨酸、脯氨酸和鸟氨酸的合成途径增加，与TMAO和嘌呤代谢相关的细菌菌落增多。HONG等［10］研究表明，肠道微生物组变化与PAH代谢组变化有关，且这些变化受到NPS2143的影响。进一步研究发现，特发性PAH和野百合碱诱导的PAH高风险大鼠模型TMAO水平升高，而特发性多环芳烃或缺氧诱导的PAH低风险小鼠模型TMAO水平则未升高，表明TMAO表达升高可能仅发生于严重PAH患者；此外，3，3-二甲基-1-丁醇是TMAO合成抑制剂，可以减轻PAH的病理改变，如其可以降低野百合碱诱导的PAH高风险大鼠模型的收缩压、最大右心房压，减轻右心室肥厚和减小肺血管厚度［11］，提示TMAO在PAH进展中具有重要作用，可能是治疗PAH的靶点。

目前，TMAO诱导PAH的具体机制尚不清楚。HUANG等［11］研究发现，DMB可以阻止巨噬细胞分泌炎症因子，从而减轻肺血管损伤。此外，PAH的最重要病理生理学机制是肺动脉平滑肌细胞增殖，而TMAO可以促进肺动脉平滑肌细胞增殖和巨噬细胞迁移［8］。TMAO仅是肠道菌群代谢产物的一种，尽管目前对其研究较多，但肠道菌群本身及其他代谢产物也可能对PAH的发生发展具有一定作用，如肠道菌群失调导致肠壁渗透性改变，细菌或细菌成分从肠道直接转移到血液循环中［12-13］；血液循环中的微生物代谢产物负荷改变可以诱导巨噬细胞激活、炎性细胞因子释放、血小板异常聚集和泡沫细胞形成，从而促进PAH的发生发展。另外，微生物菌落其他代谢产物如短链脂肪酸可激活G-蛋白偶联受体或通过抑制组蛋白去乙酰酶来改变表观遗传，进而激活调节性T淋巴细胞，发挥抗炎作用［14］。

综上所述，TMAO增加可能导致PAH，TMAO与PAH可能存在因果关系，这为临床设计PAH的微生物组依赖性代谢产物干预措施提供了思路。本研究基于大数据探讨了TMAO与PAH的因果关系，此外，ML和MRRAPS分析结果与IVW分析结果一致，表明本研究结果比较稳健。但本研究结果仍存在一定局限性：首先，不能完全排除饮食-基因或基因-环境之间的相互作用，这可能会影响研究结果；其次，无法解决孟德尔随机化分析中未观察到的多效性；最后，本研究对象为欧洲人群，该结果是否能推广至其他国家的人群尚不清楚。

作者贡献：曹溢、汪汉进行文章的构思与设计，研究的实施与可行性分析，负责撰写、修订论文；唐燕、罗强、张艺文进行数据收集、整理、分析；丰瑞谊、罗强进行结果分析与解释；汪汉负责文章的质量控制及审校，并对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。