裸花紫珠醋酸乙酯部位化学成分及抗炎活性研究

杨国栋，刘昱甫，刘永林，马 瑜，李诒光, 2，陈 杰

裸花紫珠醋酸乙酯部位化学成分及抗炎活性研究

杨国栋1，刘昱甫1，刘永林1，马 瑜1，李诒光1, 2*，陈 杰1*

1. 江西中医药大学，江西 南昌 330004 2. 江中药业股份有限公司，江西 南昌 330004

研究裸花紫珠叶的化学成分，并对分离的化合物进行初步的抗炎筛选。采用各种色谱方法（硅胶、MCI、羟丙基葡聚糖凝胶、ODS）进行分离纯化，并结合核磁、质谱数据明确其结构。通过Griess法对分离得到的化合物进行初步的抗炎活性筛选。从裸花紫珠叶中醋酸乙酯部位分离得到17个单体化合物，分别鉴定为(6,7)-3-oxo-megastigma-4,8-dien-7βglucoside（1）、phoebenoside A（2）、(6,9)-3-oxo-α-ionol-9βglucopyranoside（3）、blumenol C glucoside（4）、异毛蕊花糖苷（5）、myricoside（6）、肉苁蓉苷D（7）、地黄苷（8）、木通苯乙醇苷B（9）、4,4-dimethoxy-3-hydroxy-7,9:7,9-diepoxylignan-3βglucopyranoside（10）、木犀草素-7葡萄糖苷（11）、木犀草素- 7β葡萄糖苷（12）、木犀草素-4′β葡萄糖苷（13）、大波斯菊苷（14）、luteolin-7β--rhamnopyranosyl (1→2)-βglucopyranoside（15）、芹菜素-7β新橙皮苷（16）、2butyl-1(2′-ethylhexyl) benzene-1,8-dicarboxylate（17）。化合物7、14对NO生成抑制率达到45%以上。化合物1～4、9～11、17为首次从该属植物中分离获得。其中化合物7和14能显著抑制NO的产生，具有良好的体外抗炎效果。

裸花紫珠；抗炎活性；苯乙醇苷；黄酮；肉苁蓉苷D；大波斯菊苷

裸花紫珠Hook. Et Arn.为马鞭草科（Verbenaceae）紫珠属L.植物。目前，被收录的紫珠属植物共190余种，其中46种存在于中国，并广泛分布于华南、华中、西南等地，植物资源丰富[1]。裸花紫珠的药用部位为茎枝及叶，具有化瘀止血、抗菌解毒、消炎消肿、祛风除湿的作用。它还可以用来防御呼吸道和消化系统的出血、脓疱、急性病毒性肝炎、水火烫伤和金疮出血等病症[2]。研究表明裸花紫珠主要包括挥发油类、黄酮类、苯乙醇苷类和萜类成分[3]，具有消炎止血、杀菌、抗癌、抗阿尔兹海默症、保护肝脏等药理作用[4]。目前，裸花紫珠水提取物已开发成新药，收载于《中国药典》2020年版，其中供临床应用的中成药制剂有裸花紫珠片、裸花紫珠胶囊、裸花紫珠颗粒、裸花紫珠分散片等，主要用于治疗细菌感染引起的炎症、消化道和呼吸道出血、急性传染性肝炎等症。所以，为了更深入阐明裸花紫珠叶的化学成分，以丰富该植物的化学多样性，本实验对裸花紫珠干燥叶水提物的醋酸乙酯部位进行成分分离，最终获得17个单体成分，通过氢谱、碳谱和质谱等手段分别鉴定为(6,7)-3-oxo-megastigma- 4,8-dien-7βglucoside（1）、phoebenoside A（2）、(6,9)-3-oxo-α-ionol-9βglucopyranoside（3）、blumenol C glucoside（4）、异毛蕊花糖苷（isoacteoside，5）、myricoside（6）、肉苁蓉苷D （cistanoside D，7）、地黄苷（martynoside，8）、calceolarioside B（9）、4,4-dimethoxy-3-hydroxy- 7,9:7,9-diepoxylignan-3βglucopyranoside（10）、luteolin-7glucuronide（11）、木犀草素-7β葡萄糖苷（luteolin-7βglucoside，12）、木犀草素-4′β葡萄糖苷（luteolin-4′βglucoside，13）、大波斯菊苷（apigenin-7-glucoside，14）、luteolin-7β--rhamnopyranosyl (1→2)-βglucopyranoside（15）、芹菜素-7β新橙皮苷（apigenin-7βneohesperidoside，16）、2butyl-1(2′-ethylhexyl)benzene-1,8-dicarboxylate（17）。其中，化合物1～4、9～11、17为首次从该属植物中分离得到。初步研究了17个化合物的抗炎活性，可为裸花紫珠及其制剂质量标准提升，民族药用资源合理开发和利用提供依据。

1 材料与仪器

1.1 仪器与试剂

Bruker AM 600 MHz型核磁共振仪（德国Bruker公司）；德国IKA RV10 auto旋转蒸发仪（德国IKA公司）；依利特P3500半制备液相色谱仪（中国依利特公司）；SCIEX Triple ESI 5600+型高分辨飞行时间质谱联用仪（美国SCIEX公司）；Sephadex LH-20（美国Pharmacia公司）；C18半制备型色谱柱（日本YMC公司）；MCI-凝胶（日本三菱化学公司）；柱色谱硅胶（青岛海洋化工厂）；脂多糖、地塞米松（美国Sigma公司）；DMEM高糖培养基（中国Solarbio公司）；胎牛血清（美国Gibco公司）；NO和CCK-8试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司）；所有试剂都是色谱纯或分析纯。

1.2 材料

小鼠小胶质细胞BV2，购置于武汉大学中国典型培养物保藏中心；裸花紫珠药材购自海南省白沙黎族自治县细水乡白水港村，经江西中医药大学药学院范崔生教授所鉴定为裸花紫珠Hook. et Arn.，标本（Y202101G）保存于江中药业研发中心。

2 方法

2.1 提取与分离

裸花紫珠干燥叶3.0 kg，加水冷浸12 h，之后加热煎煮3次（3、3、2 h），滤过合并药液，将药液浓缩成浸膏状，之后加水溶解，通过醋酸乙酯萃取3次，减压浓缩，获浸膏314 g。再与硅胶混合后通过硅胶柱色谱开始粗分，首先用二氯甲烷-甲醇（500∶1～5∶1）进行梯度分离，薄层色谱引导合并，最后产生9个流分（Fr 1～9）。

Fr 6（30.14g）在MCI柱上分离，用甲醇-水溶剂体系（50%～90%）梯度分离后，点板归并得到Fr 6-1～6-5。其中Fr 6-1（8.15 g）通过硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇（300∶1～5∶1）梯度获取Fr 6-1-1～6-1-6共6个组分。Fr 6-1-3（1.04 g）使用ODS 柱色谱（甲醇-水）、半制备液相（甲醇-水，43∶57）获得化合物8（0.8 mg，R＝29.5 min）和11（1.6 mg，R＝45.3 min）。Fr 6-1-4（0.95 g）再经半制备HPLC（甲醇-水45∶55）得到化合物15（1.8 mg，R＝32.6 min）、16（2.3 mg，R＝35.7 min）。Fr 6-4（5.85 g）运用硅胶柱色谱纯化，二氯甲烷-甲醇（430∶1～5∶1）梯度获取Fr 6-4-1～6-4-6共6个组分，Fr 6-4-1经半制备液相（甲醇-水52∶48）分离得化合物1（3.6 mg，R＝24.9 min）。Fr 6-4-2采用半制备液相色谱（甲醇-水54∶46）获得化合物4（3.8 mg，R＝20.4 min）和7（4.2 mg，R＝33.6 min）。

Fr 4（86.82 g）采用Sephadex LH-20柱色谱（甲醇）进一步分离，共得4个组分Fr 4-1～4-4。Fr 4-1（12.37 g）经硅胶柱色谱，二氯甲烷-甲醇（40∶1～5∶1）梯度洗脱，得到化合物2（8 mg）和6（12 mg）。组分 Fr 4-2（9.12 g）以硅胶柱色谱纯化，经二氯甲烷-甲醇（30∶1～5∶1）分离后，再经半制备液相色谱（甲醇-水53∶47）得到化合物3（2.2 mg，R＝25.4 min）和10（4.4 mg，R＝34.7 min）。组分Fr 4-3（6.16 mg）使用Sephadex LH-20柱色谱（甲醇）进一步分离，薄层色谱引导合并，纯化Fr 4-3-1～4-3-5为5个部分。Fr 4-3-1（2.24 g）以硅胶为固定相，二氯甲烷-甲醇（20∶1～5∶1）梯度获取化合物9（2.2 mg）和12（5.4 mg）。Fr 4-3-3（2.54 g）选取硅胶柱色谱纯化，二氯甲烷-甲醇（20∶1～5∶1）分离为5个部分Fr 4-3-3-1～4-3-3-5，Fr 4-3-3-1再用半制备液相色谱（甲醇-水42∶58）得到化合物13（1.6 mg，R＝31.9 min）和14（1.7 mg，R＝42.1 min）。Fr 4-3-3-3再经半制备液相色谱（甲醇-水44∶56）得到化合物5（1.7 mg，R＝31.6 min）。

Fr 3（61.15 g）用MCI柱纯化，选取甲醇-水（70∶30～100∶0）梯度分离后，薄层色谱引导合并，以硅胶为固定相，二氯甲烷-甲醇（30∶1～5∶1）继续分离，再经半制备液相色谱（甲醇-水48∶52）得到化合物17（1.3 mg，R＝32.6 min）。

2.2 体外抗炎活性评价

2.2.1 细胞的培养及毒性评价 BV2小胶质细胞放置于培养箱中（37 ℃、5%CO2），以含有10% FBS的DMEM高糖培养液为生长液，当其生长密度至90%时进行传代。采用CCK-8法测验化合物对BV2细胞毒性的作用。然后于96孔板中接种处于对数生长期的BV2细胞，每孔细胞为9×103个，每孔100 μL，细胞贴壁后，分为空白组、地塞米松组、给药组（25 μmol/L），每组3个平行，于上述条件下培养24 h。加入10% CCK-8培养基，在37 ℃下培养3.5 h。之后，在450 nm处测定吸光度（）值。

2.2.2 NO含量的测定 于96孔板接种BV2细胞，每孔细胞为9×103个。待细胞贴壁后，设定空白组、模型组、阳性药物组和不同浓度给药组，每组设置3个平行。空白组只更换培养液，阳性药物组和目标药物组在加入脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）前预处理3.5 h，然后和模型组同时加入脂多糖（终质量浓度为1 μg/mL），培养24 h后，收集细胞培养液，严格按照NO评测试剂盒说明书进行测试。

3 结果与分析

3.1 结构鉴定

化合物1：无色油状物，分子式C19H30O7；ESI-MS/: 393.2 [M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 5.89 (1H, s, H-4), 5.79 (1H, dd,= 15.4, 6.5 Hz, H-8), 5.65 (1H, m, H-9), 4.41 (1H, t,= 7.8 Hz, H-1), 4.36 (1H, m, H-7), 3.67 (1H, dd,= 11.9, 5.4 Hz, H-6), 3.36 (1H, m, H-5), 3.29 (1H, m, H-4), 3.22 (1H, m, H-3), 3.18 (1H, m, H-2), 2.69 (1H, d,= 8.9 Hz, H-6), 2.44 (1H, d,= 16.8 Hz, H-2a), 2.06 (1H, d,= 16.8 Hz, H-2b), 1.95 (3H, s, H-11), 1.30 (3H, d,= 4.8 Hz, H-10), 1.04 (3H, s, H-13), 1.01 (3H, s, H-12)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 37.1 (C-1), 48.3 (C-2), 202.1 (C-3), 126.1 (C-4), 165.9 (C-5), 56.8 (C-6), 77.0 (C-7), 138.2 (C-8), 128.8 (C-9), 21.0 (C-10), 23.8 (C-11), 28.0 (C-12), 27.6 (C-13), 102.5 (C-1), 75.3 (C-2), 78.0 (C-3), 71.5 (C-4), 78.1 (C-5), 62.7 (C-6)。以上数据与文献报道一致[5]，故鉴定化合物1为 (6,7)-3-oxo- megastigma-4,8-dien-7βglucoside。

化合物2：无定形粉末，分子式C19H32O7；ESI-MS/: 373.2 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 4.37 (1H, d,= 7.8 Hz, H-1), 3.92 (1H, m, H-9), 3.87 (1H, dd,= 5.0, 12.4 Hz, H-6a), 3.67 (1H, dd,= 12.4, 2.0 Hz, H-6b), 3.36 (1H, t,= 8.7 Hz, H-3), 3.34 (1H, m, H-4), 3.28 (1H, m, H-5), 3.19 (1H, dd,= 7.5, 8.9 Hz, H-2), 2.55 (1H, m, H-7), 2.45 (1H, m, H-3), 1.83 (1H, t,= 7.0 Hz, H-2), 1.77 (3H, s, H-13), 1.68 (1H, m, H-8), 1.31 (1H, d,= 6.3 Hz, H-10), 1.21 (3H, s, H-11), 1.21 (3H, s, H-12)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 37.7 (C-1), 38.4 (C-2), 35.1 (C-3), 201.6 (C-4), 131.7 (C-5), 168.5 (C-6), 27.1 (C-7), 36.4 (C-8), 77.7 (C-9), 21.8 (C-10), 27.2 (C-11), 27.6 (C-12), 11.8 (C-13), 104.1 (C-1), 75.4 (C-2), 77.9 (C-3), 71.7 (C-4), 78.3 (C-5), 62.8 (C-6)。以上数据与文献报道一致[6]，故鉴定化合物2为phoebenoside A。

化合物3：白色粉末，分子式C19H30O7；ESI-MS/: 393.2 [M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 5.89 (1H, brs, H-4), 5.79 (1H, dd,= 15.4, 6.5 Hz, H-8), 5.66 (1H, dd,= 15.4, 9.3 Hz, H-7), 4.41 (1H, m, H-9), 4.36 (1H, d,= 7.8 Hz, H-1), 3.83 (1H, dd,= 11.8, 2.4 Hz, H-6), 3.67 (1H, dd,= 11.8, 5.4 Hz, H-6), 3.37 (1H, m, H-3), 3.34 (1H, m, H-4), 3.30 (1H, d,= 9.2 Hz, H-2), 3.18 (1H, m, H-5), 2.69 (1H, d,= 9.3 Hz, H-6), 2.44 (1H, d,= 16.8 Hz, H-2a), 2.06 (1H, d,= 16.8 Hz, H-2b), 1.95 (3H, s, H-13), 1.30 (3H, d,= 6.4 Hz, H-10), 1.04 (3H, s , H-12), 1.02 (3H, s, H-11)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 37.1 (C-1), 48.3 (C-2), 202.1 (C-3), 126.1 (C-4), 165.9 (C-5), 56.8 (C-6), 128.8 (C-7), 138.2 (C-8), 77.0 (C-9), 21.0 (C-10), 27.6 (C-11), 28.0 (C-12), 23.8 (C-13), 102.5 (C-1′), 75.3 (C-2′), 78.1 (C-3′), 71.5 (C-4′), 78.0 (C-5′), 62.7 (C-6′)。以上数据与文献报道一致[7]，故鉴定化合物3为(6,9)-3- oxo-α-ionol-9βglucopyranoside。

化合物4：红棕色油状液体，分子式C19H32O7；ESI-MS/: 395.2 [M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 5.81 (1H, s, H-4), 4.33 (1H, d,= 7.8 Hz, H-1), 3.85 (1H, dd,= 11.8, 1.6 Hz, H-6a), 3.83 (1H, m, H-9), 3.66 (1H, dd,= 11.8, 5.1 Hz, H-6b), 2.50 (1H, d,= 17.4 Hz, H-2), 2.06 (3H, d,= 1.4 Hz, H-13), 2.00 (1H, m, H-6), 1.81 (1H, m, H-7), 1.70 (1H, m, H-8), 1.68 (1H, m, H-7), 1.62 (1H, m, H-8), 1.26 (3H, d,= 6.3 Hz, H-10), 1.11 (3H, s, H-12), 1.03 (3H, s, H-11)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD):37.4 (C-1), 48.1 (C-2), 202.4 (C-3), 125.4 (C-4), 169.9 (C-5), 52.6 (C-6), 26.7 (C-7), 37.4 (C-8), 77.9 (C-9), 21.9 (C-10), 29.0 (C-11), 27.5 (C-12), 25.0 (C-13), 104.0 (C-1′), 75.3 (C-2′), 78.2 (C-3′), 71.7 (C-4′), 77.6 (C-5′), 62.8 (C-6′)。以上数据与文献报道一致[8]，故鉴定化合物4为blumenol C glucoside。

化合物5：白色粉末，分子式为C29H36O15；ESI-MS/: 647.2 [M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.61 (1H, d,= 15.6 Hz, H-7′′′), 6.29 (1H, d,= 15.9 Hz, H-8′′′), 6.72 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2), 6.69 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 6.58 (1H, dd,= 2.1, 8.0 Hz, H-6), 2.81 (2H, m, H-7), 3.31～4.07 (2H, m, H-8), 4.40 (1H, d,= 7.9 Hz, H-1′), 5.21 (1H, s, H-1′′), 1.11 (3H, d,= 6.2 Hz, H-6′′), 7.07 (1H, d,= 2.1 Hz, H-2′′′), 6.80 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5′′′), 6.97 (1H, dd,= 2.1, 8.2 Hz, H-6′′′)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 131.5 (C-1), 117.1 (C-2), 146.8 (C-3), 146.1 (C-4), 116.5 (C-5), 121.3 (C-6), 72.3 (C-7), 36.6 (C-8), 104.2 (C-1′), 76.0 (C-2′), 81.6 (C-3′), 70.4 (C-4′), 76.2 (C-5′), 62.3 (C-6′), 103.0 (C-1′′), 72.3 (C-2′′), 72.0 (C-3′′), 74.0 (C-4′′), 70.6 (C-5′′), 18.5 (C-6′′), 127.7 (C-1′′′), 114.7 (C-2′′′), 146.8 (C-3′′′), 149.8 (C-4′′′), 116.5 (C-5′′′), 123.2 (C-6′′′), 115.2 (C-α), 144.7 (C-β), 168.3 (C=O)。以上数据与文献报道一致[9]，故鉴定化合物5为异毛蕊花糖苷。

化合物6：无定形粉末，分子式C34H44O19；ESI-MS/: 779.3 [M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 6.71 (1H, d,= 2.1 Hz, H-2), 6.69 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 6.57 (1H, dd,= 8.1, 2.1 Hz, H-6), 2.80 (2H, m, H-7), 4.07 (1H, m, H-8a), 3.74 (1H, m, H-8b)，4.39 (1H, d,= 7.9 Hz, H-1), 3.88 (1H, m, H-3), 4.94 (1H, t,= 9.6 Hz, H-4), 3.56 (1H, m, H-5), 3.63 (1H, s, H-6a), 3.42 (1H, m, H-6b)，5.29 (1H, d,= 1.8 Hz, H-1), 3.85 (1H, d,= 9.2 Hz, H-2), 3.68 (1H, dd,= 9.4, 3.3 Hz, H-3), 1.13 (3H, d,= 6.2 Hz, H-6)，5.22 (1H, d,= 2.7 Hz, H-1), 7.08 (1H, d,= 2.1 Hz, H-2), 6.82 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5), 6.99 (1H, dd,= 8.2, 2.1 Hz, H-6), 7.60 (1H, d,= 15.9 Hz, H-7), 6.26 (1H, d,= 15.9 Hz, H-8)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 131.5 (C-1), 116.2 (C-2), 146.1 (C-3), 144.6 (C-4), 117.0 (C-5), 121.2(C-6), 72.2 (C-α), 36.5 (C-β), 104.1 (C-1′), 75.9 (C-2′), 80.4 (C-3′), 70.3 (C-4′), 76.4 (C-5′), 62.2 (C-6′), 102.1 (C-1′′), 72.4 (C-2′′), 80.1 (C-3′′), 72.5 (C-4′′), 68.8 (C-5′′), 18.7 (C-6′′), 111.4 (C-1′′′), 78.5 (C-2′′′), 80.0 (C-3′′′), 74.8 (C-4′′′), 65.7 (C-5′′′), 127.6 (C-1′′′′), 115.2 (C-2′′′′), 146.9 (C-3′′′′), 149.9 (C-4′′′′), 116.6 (C-5′′′′), 123.3 (C-6′′′′), 114.6 (C-α), 148.0 (C-β), 168.2 (C=O)。以上数据与文献报道一致[10]，故鉴定化合物6为myricoside。

化合物7：白色粉末；分子式C31H40O15；ESI-MS/: 675.2 [M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 6.82 (1H, d,= 2.4 Hz, H-2), 6.74 (1H, d,= 8.1 Hz, H-5), 6.69 (1H, dd,= 8.2, 2.1 Hz, H-6), 2.83 (2H, m, H-7), 4.07 (1H, t,= 9.7 Hz, H-8a), 3.85 (1H, m, H-8b), 3.82 (3H, s, OCH3)，4.39 (1H, d,= 7.9 Hz, H-1), 4.93 (1H, t,= 9.3 Hz, H-4), 5.21 (1H, s, H-1), 1.11 (3H, d,= 6.2 Hz, H-6), 7.20 (1H, d,= 1.9 Hz, H-2), 6.83 (1H, d,= 7.8 Hz, H-5), 7.09 (1H, dd,= 8.2, 2.0 Hz, H-6), 7.67 (1H, d,= 15.9 Hz, H-7), 6.38 (1H, d,= 15.9 Hz, H-8), 3.89 (3H, s, OCH3)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 132.9 (C-1), 112.8 (C-2), 147.9 (C-3), 147.5 (C-4), 117.1 (C-5), 121.1 (C-6), 36.5 (C-7), 72.3 (C-8), 56.4 (3-OCH3), 104.2 (C-1′), 76.0 (C-2′), 81.5 (C-3′), 70.4 (C-4′), 76.0 (C-5′), 62.4 (C-6′), 103.0 (C-1′′), 72.1 (C-2′′), 72.3 (C-3′′), 73.8 (C-4′′), 70.6 (C-5′′), 18.4 (C-6′′), 127.6 (C-1′′′), 111.8 (C-2′′′), 147.4 (C-3′′′), 149.4 (C-4′′′), 116.5 (C-5′′′), 124.4 (C-6′′′), 149.4 (C-7′′′), 115.1 (C-8′′′), 168.3 (C-9′′′), 56.5 (3′-OCH3)。以上数据与文献报道一致[11]，故鉴定化合物7为肉苁蓉苷 D。

化合物8：棕黄色油状物；分子式C31H40O15；ESI-MS/: 675.2 [M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.67 (1H, d,= 15.9 Hz, H-7), 6.38 (1H, d,= 15.9 Hz, H-8), 7.21 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2), 7.09 (1H, dd,= 8.2, 2.0 Hz, H-6), 6.82 (2H, dd,= 8.2, 10.0 Hz, H-5, 5), 6.75 (1H, d,= 2.1 Hz, H-2), 6.70 (1H, dd,= 8.2, 2.2 Hz, H-6), 3.90 (3H, s, OCH3), 2.83 (2H, m, H-7), 4.39 (1H, d,= 7.9 Hz, H-1), 4.93 (1H, t,= 9.4 Hz, H-4), 5.21 (1H, s, H-1), 1.11 (3H, d,= 6.2 Hz, H-6), 3.82 (3H, s, OCH3)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 132.9 (C-1), 112.8 (C-2), 147.6 (C-3), 147.4 (C-4), 117.1 (C-5), 121.1 (C-6), 72.1 (C-7), 36.6 (C-8), 56.5 (4-OCH3), 104.2 (C-1), 76.2 (C-2), 81.5 (C-3), 70.6 (C-4), 76.1 (C-5), 62.4 (C-6), 103.0 (C-1), 72.4 (C-2), 72.1 (C-3), 73.8 (C-4), 70.4 (C-5), 18.4 (C-6), 127.5 (C-1), 111.7 (C-2), 149.5 (C-3), 151.1 (C-4), 116.5 (C-5), 124.4 (C-6), 147.9 (C-7), 115.0 (C-8), 168.3 (C-9), 56.4 (4-OCH3)。以上数据与文献报道一致[12]，故鉴定化合物8为地黄苷。

化合物9：棕色油状物；分子式C23H26O11；ESI-MS/: 501.1 [M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz , CD3OD): 6.68 (1H, d,= 2.3 Hz, H-2), 6.64 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 6.55 (1H, dd,= 8.1, 2.3 Hz, H-6), 2.79 (2H, m,= 7.6 Hz, H-7), 3.97 (1H, m, H-8a), 3.72 (1H, m, H-8b), 4.33 (1H, d,= 7.9 Hz, H-1), 3.23 (1H, m, H-2), 3.40 (1H, m, H-3), 3.37(1H, m, H-4), 3.52 (1H, m, H-5), 4.51 (1H, m, H-6a), 4.34 (1H, m, H-6b), 7.04 (1H, d,= 2.3 Hz, H-2), 6.90 (1H, dd,= 8.3, 2.3 Hz, H-6), 6.78 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5), 7.57 (1H, d,= 15.8 Hz, H-7), 6.30 (1H, d,= 15.9 Hz, H-8)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 131.4 (C-1), 116.5 (C-2), 146.8 (C-3), 146.1 (C-4), 116.3 (C-5), 121.2 (C-6), 72.4 (C-α), 36.7 (C-β), 104.6 (C-1), 75.1 (C-2), 77.9 (C-3), 71.7 (C-4), 75.5 (C-5), 64.6 (C-6), 127.7 (C-1″), 114.8 (C-2″), 147.2 (C-3″), 149.6 (C-4″), 117.1 (C-5″), 123.2 (C-6″), 144.7 (C-7″), 115.0 (C-8″), 169.2 (C-9″)。以上数据与文献报道一致[13]，故鉴定化合物9为calceolarioside B。

化合物10：白色粉末，分子式C26H32O11；ESI-MS/: 543.2 [M＋Na]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.15 (1H, d,= 8.3 Hz, H-5), 7.04 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2), 6.95 (1H, d,= 1.9 Hz, H-2′), 6.93 (1H, dd,= 8.4, 2.0 Hz, H-6), 6.82 (1H, dd,= 8.4, 2.0 Hz, H-6′), 6.77 (1H, d,= 8.1 Hz, H-5′), 4.72 (1H, d,= 6.1 Hz, H-1″), 4.24～4.28 (2H, m, H-9, 9′), 3.88 (3H, s, OCH3), 3.86 (1H, s, OCH3), 3.85 (1H, s), 3.69 (2H, m, H-9′), 3.49 (1H, m, H-6″a), 3.47 (1H, m, H-6″b), 3.39～3.40 (4H, m, H-2″～5″), 3.14 (2H, m, H-8, H-8′)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 137.5 (C-1), 111.6 (C-2), 147.5(C-3), 151.0 (C-4), 118.0 (C-5), 119.8 (C-6), 87.1 (C-7), 55.5 (C-8), 72.7 (C-9), 133.7 (C-1′), 111.0 (C-2′), 147.4 (C-3′), 149.1 (C-4′), 116.1 (C-5′), 120.1 (C-6′), 87.5 (C-7′), 55.4 (C-8′), 72.7 (C-9′), 56.4 (4-OCH3), 56.7 (4-OCH3), 102.9 (C-1″), 74.9 (C-2″), 77.8 (C-3″), 71.3 (C-4″), 78.2 (C-5″), 62.5 (C-6″)。以上数据与文献报道一致[14]，故鉴定化合物10为4,4-dimethoxy-3-hydroxy- 7,9:7,9-diepoxylignan-3βglucopyranoside。

化合物11：淡黄色粉末，分子式C21H18O12；ESI-MS/: 462.1 [M－H]−。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.45 (1H, dd,= 8.4, 2.1 Hz, H-6′), 7.43 (1H, d,= 2.1 Hz, H-2′), 6.94 (1H, d,= 8.4 Hz, H-5′), 6.79 (1H, d,= 2.2 Hz, H-8), 6.64 (1H, s, H-3), 6.51 (1H, d,= 2.2 Hz, H-6), 5.21 (1H, d,= 7.9 Hz, H-1″), 3.56～4.19 (4H, m, H-2″～5″)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 166.9 (C-2), 104.2 (C-3), 184.1 (C-4), 163.0 (C-5), 101.4 (C-6), 164.4 (C-7), 96.0 (C-8), 158.9 (C-9), 107.3 (C-10), 123.5 (C-1′), 114.3 (C-2′), 147.1 (C-3′), 151.2 (C-4′), 116.8 (C-5′), 120.5 (C-6′), 101.0 (C-1″), 74.4 (C-2″), 77.0 (C-3″), 72.8 (C-4″), 76.7 (C-5″), 170.8 (C-6″)。以上数据与文献报道一致[15]，故鉴定化合物11为luteolin-7glucuronide。

化合物12：淡黄色粉末，分子式C21H20O11；ESI-MS/: 449.1 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 12.99 (1H, s, 5-OH), 7.47 (1H, dd,= 8.5, 2.3 Hz, H-6), 7.45 (1H, d,= 2.3 Hz, H-2), 7.33 (1H, d,= 8.5 Hz, H-5), 6.62 (1H, s, H-3), 6.46 (1H, d,= 2.1 Hz, H-8), 6.22 (1H, d,= 2.1 Hz, H-6), 4.95 (1H, d,= 7.6 Hz, H-1″), 3.93～3.44 (6H, m, sugar-H)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 165.5 (C-2), 103.2 (C-3), 183.8 (C-4), 159.5 (C-5), 100.3 (C-6), 166.3 (C-7), 95.1 (C-8), 163.3 (C-9), 105.4 (C-10), 119.8 (C-1), 114.9 (C-2), 148.7 (C-3), 150.0 (C-4), 118.0 (C-5), 127.3 (C-6), 105.1 (C-1″), 71.3 (C-2″), 74.8 (C-3″), 78.5 (C-4″), 77.5 (C-5″), 62.4 (C-6″)。以上数据与文献报道一致[16]，故鉴定化合物12为木犀草素-7β葡萄糖苷。

化合物13：淡黄色粉末，分子式C21H20O11；ESI-MS/: 449.1 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 12.92 (1H, s, 5-OH), 7.47 (1H, d,= 8.5 Hz, H-6), 7.45 (1H, s, H-2), 7.33 (1H, d,= 8.5 Hz, H-5), 6.62 (1H, s, H-3), 6.46 (1H, d,= 2.1 Hz, H-8), 6.22 (1H, d,= 2.1 Hz, H-6), 4.95 (1H, d,= 7.6 Hz, H-1″), 3.93～3.44 (6H, m, H-2″～6″)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 166.3 (C-2), 105.1 (C-3), 183.8 (C-4), 163.3 (C-5), 100.3 (C-6), 165.5 (C-7), 95.1 (C-8), 159.5 (C-9), 105.4 (C-10), 127.3 (C-1), 114.9 (C-2), 148.7 (C-3), 150.0 (C-4), 118.0 (C-5), 119.8 (C-6), 103.2 (C-1″), 74.8 (C-2″), 78.5 (C-3″), 71.3 (C-4″), 77.5 (C-5″), 62.4 (C-6″)。以上数据与文献报道一致[17]，故鉴定该化合物13为木犀草素-4β葡萄糖苷。

化合物14：淡黄色粉末，分子式C21H20O10；ESI-MS/: 471.2 [M＋K]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.90 (2H, d,= 8.4 Hz, H-6, 2), 6.94 (2H, d,= 8.4 Hz, H-5, 3), 6.84 (1H, s, H-3), 6.67 (1H, s, H-8), 6.51 (1H, d,= 2.0 Hz, H-6), 5.08 (1H, d,= 6.3 Hz, H-1″)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 166.8 (C-2), 104.1 (C-3), 184.1 (C-4), 159.0 (C-5), 101.2 (C-6), 164.8 (C-7), 96.1 (C-8), 162.9 (C-9), 107.1 (C-10 ), 123.0 (C-1), 129.7 (C-2, 6), 117.1 (C-3, 5), 163.2 (C-4), 101.6 (C-1″), 74.7 (C-2″), 77.9 (C-3″), 71.3 (C-4″), 78.4 (C-5″), 62.5 (C-6″)。以上数据与文献报道一致[18]，故鉴定化合物14为大波斯菊苷。

化合物15：淡黄色粉末，分子式C27H30O15；ESI-MS/: 593.2 [M－H]−。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.43 (1H, dd,= 8.3, 2.3 Hz, H-6), 7.41 (1H, d,= 2.3 Hz, H-2), 6.91 (1H, d,= 8.3 Hz, H-5), 6.77 (1H, d,= 2.2 Hz, H-8), 6.61 (1H, s, H-3), 6.47 (1H, d,= 2.2 Hz, H-6), 5.30 (1H d,= 1.8 Hz, H-1′′′), 5.21 (1H, d,= 7.7 Hz, H-1"), 1.34 (3H, d,= 6.2 Hz, H-6′′′)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 166.9 (C-2), 104.2 (C-3), 184.0 (C-4), 163.0 (C-5), 100.9 (C-6), 164.4 (C-7), 95.9 (C-8), 159.1 (C-9), 107.1 (C-10), 123.5 (C-1′), 114.3 (C-2′), 147.1 (C-3′), 151.3 (C-4′), 116.8 (C-5′), 120.5 (C-6′), 99.8 (C-1″), 78.3 (C-2″), 79.0 (C-3″), 71.4 (C-4″), 79.1 (C-5″), 62.4 (C-6″), 102.6 (C-1′′′), 72.2 (C-2′′′), 72.2 (C-3′′′), 74.0 (C-4′′′), 70.0 (C-5′′′), 18.3 (C-6′′′)。以上数据与文献报道一致[19]，故鉴定化合物15为luteolin-7β--rhamnopyranosyl(1→2)-βglucopyranoside。

化合物16：黄色粉末，分子式C27H31O14；ESI-MS/: 577.2 [M－H]−。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.78 (2H, d,= 9.0 Hz, H-2′, 6′), 6.94 (2H, m, H-3′, 5′), 6.79 (1H, d,= 2.2 Hz, H-8), 6.66 (1H, s, H-3), 6.46 (1H, d,= 2.2 Hz, H-6), 5.30 (1H, d,= 1.8 Hz, H-1‴), 5.21 (1H, d,= 7.6 Hz, H-1″), 1.34 (3H, d,= 6.2 Hz, H-6‴)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 164.4 (C-2), 104.1 (C-3), 184.0 (C-4), 163.0 (C-5), 102.5 (C-6), 166.8 (C-7), 95.9 (C-8), 159.0 (C-9), 107.0 (C-10), 123.0 (C-1′), 129.6 (C-2′, 6′), 117.1 (C-3′, 5′), 162.9 (C-4′), 99.8 (C-1″), 79.1 (C-2″), 79.0 (C-3″), 71.4 (C-4″), 78.3 (C-5″), 62.4 (C-6″), 101.0 (C-1‴), 72.2 (C-2‴), 72.2 (C-3‴), 74.0 (C-4‴), 70.0 (C-5‴), 18.3 (C-6‴)。以上数据与文献报道基本一致[20]，故鉴定化合物16为芹菜素-7β新橙皮苷。

化合物17：黄色粉末，分子式C20H30O4；ESI-MS/: 335.2 [M＋H]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.73 (2H, dd,= 5.7, 3.3 Hz, H-3, 6), 7.63 (2H, dd,= 5.8, 3.3 Hz, H-4, 5), 4.30 (4H, m, H-1), 4.23 (2H, m, H-1), 1.72 (3H, m, H-2, 2), 1.45 (4H, m, H-3, a), 1.36 (6H, m, H-3～5), 0.95 (9H, m, 3×CH3, H-4, 6, b)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 130.6 (C-1, 2), 129.9 (C-3, 6), 133.6 (C-4), 132.4 (C-5), 66.7 (C-1), 31.7 (C-2), 20.3 (C-3), 14.4 (C-4, 6), 169.3 (CO), 69.1 (C-1), 40.2 (C-2), 31.6 (C-3), 30.1 (C-4), 24.0 (C-5), 25.0 (C-a), 11.4 (C-b)。以上数据与文献报道基本一致[21]，故鉴定化合物17为2butyl-1(2-ethylhexyl) benzene-1,8-dicarboxylate。

3.2 抗炎活性测试

近年来，治疗炎症性疾病药物的需求在不断上升，抗炎方面的生物活性成为国内外研究的热点。巨噬细胞在炎症的产生当中具有重要影响，其受到外源体等刺激后会产生一定的促炎因子和抗炎因子，在机体的炎症反应当中扮演着重要角色，因此为了缓解炎症可以通过抑制炎症介质的产生以及相关的信号通路的激活[22]。NO是一种值得注意的炎症介质，具有神经毒性，其在中枢神经系统中过量表达会激活小胶质细胞并引起炎症反应[23]。NO与多种炎症疾病的产生紧密相关，普遍认为是炎症产生的标志。本课题组通过评估所分离的化合物对LPS刺激BV2细胞分泌炎症介质NO的影响，进行抗炎活性初筛。首先，采用CCK-8法测定化合物是否具有细胞毒性，以确保后续实验在无毒条件下进行。实验结果表明，当化合物浓度为25 μmol/L时，所有化合物对BV2细胞存活率均高于85%。之后采用Griess法对化合物1～17对LPS诱导BV2细胞产生NO的抑制作用进行了进一步的测试，结果见表1，化合物7和14能显著抑制NO的产生。

表1 化合物1～17对LPS诱导的BV2细胞产生NO的抑制效果

Table 1 Inhibitory effect of compounds 1—17 on NO production in LPS-induced BV2 microglial cells

化合物NO抑制率/%化合物NO抑制率/% 126.19±0.041036.78±0.06 227.28±0.021128.62±0.03 325.94±0.041219.00±0.06 426.55±0.081322.29±0.03 511.57±0.031445.19±0.03 625.09±0.061514.13±0.06 746.16±0.06168.77±0.02 832.03±0.071712.91±0.03 914.74±0.11地塞米松43.85±0.03

4 讨论

近年来，裸花紫珠的研发工作日益拓展广泛，涉及了药材资源、化学物质、生产工艺、药理疗效以及临床使用价值等诸多方面。裸花紫珠相关产品的开发，其化学成分与药理学的系统研究是基础。本研究从裸花紫珠醋酸乙酯部位得到17个成分，当中包含了4个倍半萜类化合物，5个苯乙醇苷类化合物，6个黄酮类化合物，1个木脂素类化合物和1个其他类型化合物。其中，化合物1～4属于倍半萜类，5～9为苯乙醇苷类，10为木脂素类化合物，11～16为黄酮类化合物，17为其他类型化合物。化合物1～4、9～11、17为首次从该属中分离得到，抗炎活性结果证明化合物7和14对LPS诱导的小鼠小胶质细胞BV2产生炎症介质NO具有良好抑制活性，优于阳性对照地塞米松。

综上所述，本实验丰富了裸花紫珠叶化学成分和药效作用的研究，实验结果进一步考证了裸花紫珠叶的传统功效用途，为进一步生物活性研究及质控指标成分提供科学依据，并为该药物在未来的开发使用过程中提供一定的理论支持。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Chemical constituents from ethyl acetate extract ofand its anti-inflammatory activity

YANG Guo-dong1, LIU Yu-fu1, LIU Yong-lin1, MA Yu1, LI Yi-guang1, 2, CHEN jie1

1. Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China 2. Jiangzhong Pharmaceutical Co., Ltd,Nanchang 330004, China

To study of the chemical composition of the ethyl acetate parts of, and preliminary screen out the isolated compounds with anti-inflammatory activities.Various chromatographic methods (silica gel, MCI, hydroxypropyl dextran gel, ODS) were used for the isolation and purification, and the structure was clarified by combination with NMR and MS data. The isolated compoundswere screened for preliminary anti-inflammatory activity by the Griess method.Seventeen monomeric compounds were isolated from, which were identified as (6,7)-3-oxo-megastigma- 4,8-dien-7βglucoside (1), phoebenoside A (2), (6,9)-3-oxo-α-ionol-9βglucopyranoside (3), blumenol C glucoside(4), isoacteoside (5), myricoside (6), cistanoside D (7), martynoside (8), calceolarioside B (9), 4,4-dimethoxy-3-hydroxy-7,9:7,9- diepoxylignan-3βglucopyranoside (10), luteolin-7glucuronide (11), luteolin-7βglucoside (12), luteolin-4′βglucoside (13), apigenin-7-glucoside (14), luteolin-7β--rhamnopyranosyl(1→2)-βglucopyranoside (15), apigenin-7βneohesperidoside (16), 2butyl-1(2′-ethylhexyl) benzene-1,8-dicarboxylate (17). Compounds 7 and 14 inhibited NO production by more than 45%.Compounds 1—4, 9—11 and 17 are the first isolated from this genus. Among them, compounds 7 and 14 significantly inhibited NO production and had goodanti-inflammatory effects.

Hook. Et Arn.; anti-inflammatory activity; phenylethanol glycoside; flavonoid; cistanoside D; apigenin- 7-glucoside

R284.1

A

0253 - 2670(2023)16 - 5146 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.16.003

2023-01-29

江西省重点研发计划项目（20212BBG71007）

杨国栋（1996—），男，研究方向为中药药效物质基础。E-mail: yang2428844581@163.com

陈 杰，女，副教授，研究方向为中药药效物质基础。E-mail: 19960246@jxutcm.edu.cn

李诒光，男，博士，教授，研究方向为中药质量控制及产品开发。E-mail:lyg@crjz.com

[责任编辑 王文倩]