烟草品质性状相关基因挖掘与功能解析研究进展

陈帅　任民　杨爱国

摘要：高品质烟草品种培育是烟草育种的重要方面。随着烟草基因组学的发展，烟草科研工作者在品质等烟草复杂性状基因挖掘和功能解析方面取得了一系列重要的原创性研究成果，为烟草生物育种和分子设计育种的开展储备了大量基因资源。本文系统梳理了烟草多酚类物质合成、腺毛分泌物、烟碱生物合成等3个方面的功能基因挖掘和调控机理解析方面的研究进展，认为利用多组学技术、基因编辑技术、合成生物学技术等进行基因挖掘和功能鉴定分析是今后研究的重要发展方向。针对目前烟草品质育种存在的问题和不足，指出要深入开展种质资源鉴定，加强功能基因的挖掘和研究，实现新型前沿技术突破，进而为培育烟草香气品质突破性品种奠定基础。

关键词：烟草；品质育种；基因挖掘；功能解析；研究进展

中图分类号： S572.03         文献标识码： A         文章编号：1007-5119（2023）03-0099-08

Advances in Discovery and Functional Analysis of Quality Related Genes in Tobacco

CHEN Shuai， REN Min， YANGAiguo

（Tobacco Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China）

Abstract： The cultivation of high quality tobacco varieties is an important aspect of tobacco breeding. With the development of tobacco genomics， tobacco researchers have made a series of important original research achievements in dissecting complex traits in tobacco， such as quality， providing numerous genetic resources for tobacco breeding. This review aims to summarize the progress of gene discovery and functional analysis of polyphenol metabolism， glandular trichome and nicotine biosynthesis in tobacco. It is considered that exploiting candidate genes by using multi-omics technology， conducting functional identification by gene editing technology and synthetic biology technology， are important development directions for future research. Moreover， it is pointed out that further and more depth research on germplasm resources， strengthening the exploration and research of functional genes， and making breakthroughs in new technologies， are necessary to resolve the problems and shortcomings in tobacco quality breeding.

Keywords： tobacco; quality breeding; gene discovery; function analysis; research progress

煙草是重要的模式植物和经济作物。烟草品质是一个综合概念，影响因素众多，利用常规育种技术很难实现突破。如何突破传统遗传育种技术的瓶颈，将烟草分子遗传学和功能基因组学的研究成果应用于烟草品质育种，实现更加高效和精准的烟草生物育种，是烟草育种面临的重要科学问题。烟草基因组计划实施，在基因组水平上进行了大规模的基因功能分析，为研究基因表达调控机理提供了空前的契机。

影响烟草品质的致香物质种类繁多，主要包括多酚类物质、萜烯类物质、生物碱类、糖脂类物质等。结构基因和调控基因的挖掘和功能分析，能够将烟草香气性状与具体的功能基因联系起来，实现从基因到香气性状的直接调控。依托丰富的烟草种质资源和日新月异的现代生物技术手段，大量与烟草多酚类物质合成、腺毛分泌物、烟碱生物合成相关的功能基因和调控基因被不断地挖掘和解析，为利用基因手段改善烟草品质提供重要的靶标基因和理论基础。本文系统总结了烟草多酚类物质合成、腺毛分泌物、烟碱生物合成3个方面的功能基因及其调控机理研究进展，为烟草品质分子育种研究工作提供理论参考。

1 烟草多酚类物质合成相关基因研究进展

烟草多酚类物质与烟草品质密切相关，烟草燃吸时，多酚类物质燃烧产生各种含有芳香气味的成分，赋予烟气清甜香和烤香特征。绿原酸、芸香苷、莨菪亭是烟叶中主要的多酚类物质，经由植物苯丙烷代谢通路合成[1]。近年来，多酚合成代谢相关的一些关键结构基因、转录因子、调控蛋白等重要基因被陆续分离克隆，对多酚合成代谢机理研究和烟草分子育种工作产生了重要推动作用。

1.1 多酚合成相关基因

目前已从烟草中分离或克隆获得多个参与多酚类物质合成的结构酶基因。PAL、C4H、4CL、CHS、 CHI、DFR、FLS、F3H、ANS 等结构基因已经在烟草成功克隆并被证实在烟草多酚类物质合成中发挥重要功能。陈帅等[2-3]从普通烟草中克隆到了7个 CHS 基因，过量表达 NtCHS1基因引起绿原酸和芸香苷含量显著增加，而基因沉默后引起绿原酸和芸香苷含量显著降低，明确了 NtCHS1基因在调控绿原酸、芸香苷合成中的重要功能。 Nishihara 等[4] 利用 RNAi 干扰技术将烟草 CHI 基因沉默，引起花青素合成减少，查尔酮合成增加，说明烟草 CHI 蛋白在查尔酮环化形成黄烷酮的过程中发挥重要作用。 NtDFR1和 NtDFR2基因沉默，引起烟草花青素含量显著降低，花色变为浅粉或白色，而黄酮醇含量显著增加，说明 DFR 基因在花青素合成中发挥重要作用，同时也作为分支部位的关键酶调控不同类黄酮的合成[5]。Mahajan 等[6]将 FLS 基因沉默后，沉默转基因株系槲皮素、花青素含量显著降低，而儿茶酚、表儿茶酚、表没食子儿茶素含量升高，花粉发育和萌发受阻。过量表达 NtFLS2基因引起转基因烟草芸香苷含量增加[7]。Wang 等[8]鉴定到2个NtFLS基因、2个NtANS基因和4个NtF3H 基因，分析了其进化关系和在类黄酮合成中的重要功能。 Jiao 等[9]利用代谢组和转录组分析云烟87白花突变体挖掘参与花青素合成的功能基因，发现结构酶基因 CHI、DFR 、F3H、UFGTs 等基因的表达量在白花突变体中显著下调表达，推测其可能在花青素合成中发挥功能。对不同花色的花烟草进行转录组分析[10]，发现 F3H、F3'5'H 和 DFR 基因在红花和紫花烟草中较白花烟草显著上调表达，而 FLS 显著下调表达，与 HY5、MYB12、AN1和AN4同源的转录因子在不同花色烟草中也呈现出差异表达。Taguchi 等[11]克隆到一个酰基转移酶基因 NtMaT1，抑制其表达会增加黄酮类物质的丙二酰化和糖苷化。贾宏防等[12]对广东、安徽和河南3个不同生态区的烤烟品种的类黄酮合成关键酶基因的表达情况进行分析发现，不同生态区不同品种间关键酶基因 PAL 、 CHS 和 CHI 的表达强度和表达趋势差异较大， C4L 和4CL 的表达强度和表达趋势差异较小，说明PAL、 CHS 和 CHI，尤其是 CHI 基因在3个生态区浓香型烤烟类黄酮物质形成中起关键作用。

1.2 多酚合成调控基因

烟草多酚类物质生物合成代谢的调控主要包括转录水平的调控和转录后调控。目前，转录水平的调控研究较为广泛和深入，大量的转录因子被陆续克隆并证实在多酚合成代谢中发挥重要功能。 MYB 类转录因子、bHLH类转录因子、AP2类转录因子、WRKY 类转录因子等主要参与类黄酮合成代谢的调控[13-14]。上述转录因子形成一个复杂的调控网络，调控类黄酮合成代谢。研究发现，MYB-R2R3类转录因子 NtAn2在调控烟草花青素合成中发挥重要作用，过表达或 RNAi 抑制表达 NtAn2能够引起转基因烟草花中花青素的含量变化[15]。NtAn1a 和 NtAn1b 两个bHLH转录因子能够共同参与烟草花朵中花青素途径的调节[16]。Chen 等[3]发现转录因子 NtMYB4能够抑制 NtCHS1基因的表达水平，负调控类黄酮合成。Wang 等[17]克隆到两个 NtMYB12转录因子 NtMYB12a 和 NtMYB12b，这两个转录因子均参与类黄酮合成，其中 NtMYB12a 还能够响应蔗糖信号来抑制脂肪酸的积累。 Li 等[18]发现 TTG2和 ARF8能够形成复合体调控 ANS 和 DFR 基因的表达，在花青素合成中发挥重要调控作用。 Wang 等[17]在普通烟草中克隆到4个 WRKY11转录因子，将 WRKY11b 基因沉默后黄酮醇的含量大幅降低，过表达后黄酮醇含量显著升高。进一步分析发现， WRKY11b 能够与 NtMYB12、NtFLS、NtGT5、NtUFGT的启动子结合激活上述基因的表达[19]。 NtWRKY41a 能够诱导NtCCoAOMT和NtHST基因转录、同时抑制 NtF6'H1和 NtGT3基因表达。 NtWRKY41a 过表达烟株烟叶绿原酸含量升高，类黄酮和莨菪亭含量则分别降低，而 NtWRKY41a 基因敲除材料烟叶绿原酸含量降低，类黄酮和莨菪亭含量分别升高[20]。

类黄酮合成的转录后水平调控研究和报道相对较少。 Wang 等[21]克隆到一个烟草 F-box 蛋白 NtCOI1，在转录后水平调控花青素的合成。分析发现 NtCOI1位于类黄酮調控因子 NtMYB305上游，利用 RNAi 干扰技术将 NtCOI1 沉默表达， NtMYB305的表达显著下调，引起雄性不育、花青素合成受阻、茉莉酸不敏感等，并影响淀粉合成。苯丙氨酸合成酶（PAL）和查尔酮合成酶（CHS）能够经26S 蛋白酶复合体降解，揭示了苯丙氨酸和类黄酮合成的转录后水平调控方式。研究发现，在拟南芥中， KFBPAL 、 KFBCHS （ Kelch domain-containing F-box protein）分别与 PAL、CHS 蛋白直接结合，介导 PAL 和 CHS 蛋白的泛素化降解。 KFBPAL、KFBCHS 转录水平的表达调控与植物体内 PAL 和 CHS 蛋白积累浓度呈负相关，与苯丙烷物质以及花青素的积累呈负相关[22-24]。

目前，烟草多酚合成途径涉及的调控网络复杂，并不明晰。通过基因工程、突变体创制、基因编辑和合成生物学等手段调控结构基因的表达可以创制不同多酚含量的梯度材料，准确评估不同梯度多酚含量对烟草品质的影响，从而明确多酚物质在烟草品质中的贡献。基于目前已经挖掘鉴定的功能基因，鉴定与目标基因同效等位基因，开发分子标记，筛选优质种质材料，为精准鉴定种质资源多酚性状表型提供靶标基因，同时为培育高含量多酚烟草提供遗传材料。

2 烟草腺毛分泌代谢物相关基因研究进展

烟草叶片的成熟度、烟叶的品质、以及病虫害抗性都和腺毛有着密切的关系[25]。调控烟叶表面腺毛的密度及其主要代谢物的含量，有助于提高烟草抗逆性及烟叶品质。研究发现，烟草表皮毛多数是有腺型腺毛，能产生多种次生代谢物质，主要包括类西柏烷（单环）和类赖百当二萜（双环）、糖酯、表面蜡三大类[26]。其中二萜和糖酯是烟草腺毛分泌物中含量最丰富的两大类物质，对烟叶的香气品质具有重要影响。但目前对于烟草萜烯类、糖脂类合成途径认识、研究较少，合成途径尚不明确，有待进一步解析，严重影响了高萜烯类、高糖脂类烟草品质育种的进程。冷杉醇等二萜类物质合成基因、糖脂合成基因的挖掘与克隆，为解析相应合成途径提供了重要的线索，同时为萜烯类、糖脂类烟草的分子育种和设计育种提供重要的靶标基因和理论基础。

2.1 腺毛发育相关基因

Liu 等[27]在本氏烟中克隆到一个 C2H2類转录因子NbGIS，研究发现NbGIS转录因子通过结合 NbMYB123-like 转录因子响应 GA 信号正向调控腺毛分化，过量表达NbGIS会引起腺毛密度增加。将 NtabSPL6-1在烟草中过量表达引起转基因材料腺毛密度增加[28]。Wu 等[29]在本氏烟中克隆到两个转录因子Nbwo和 NbCycB2，Nbwo活性提高会增加烟草腺毛发育和腺毛密度，而 NbCycB2通过抑制Nbwo的表达活性负调控腺毛的发育。Choi 等[30]克隆到一个在长柄腺毛中特异表达的 NtLTP1基因，在腺头的油脂分泌中发挥重要功能。 Wang 等[31]在烟草中克隆到一个 NtCycB2基因，敲除 NtCycB2能够促进长柄腺毛的发育，而过量表达 NtCycB2则降低长柄腺毛的密度，但对其他类型腺毛没有影响，说明 NtCycB2只影响长柄腺毛的发育。与野生型对照相比，NtCycB2过量表达转基因烟草会分泌更多的二萜类化合物和糖脂，并表现出更强的蚜虫抗性。利用CRSPR/Cas9编辑技术敲除K326中的NtCycB2 基因，NtCycB2纯合缺失突变体 HK326的长柄腺毛的腺毛密度和腺头大小显著增加，根系更加茂盛，细胞膜稳定性增加，光合性能增加，镉毒害耐受性显著增强[32]。为研究腺毛特异表达基因的功能，烟草腺毛特异表达启动子也被相继克隆，如 CYP71D16[33]、pRbcS-T1和 pMALD1[34]。

2.2 二萜类物质合成相关基因

Sallaud等[35]从烟草中克隆NtCPS2和NtABS基因，发现这两个基因都参与冷杉醇的合成。NtABS能够将NtCPS2催化产生的8-羟基-柯巴基焦磷酸脂转化为冷杉醇。分析 NtCPS2和NtABS在不同类型烟草中的序列多态性，NtABS的 cDNA 序列在157份含有和不含冷杉醇烟草中没有差异，而 NtCPS2的cDNA 序列在含有和不含冷杉醇烟草中种质中存在两种类型的多态性，说明 NtCPS2在烟草冷杉醇合成中发挥主要功能。 NtCPS2敲除突变体冷杉纯和赖百当二醇的含量显著减低。利用 NtCPS2基因的多态性，王国平等[36]设计开发了一套 SNP 功能标记，能够有效鉴定含冷杉醇的种质资源。为进一步挖掘冷杉醇合成基因，利用转录组测序分析 NtCPS2敲除突变体内的差异表达基因，发现 KSL4基因和编码 ent-kaur-16-ene 合成酶的基因可能会参与冷杉醇的合成[37]。Wang 等[38]分离到一个腺毛特异表达的 P450羟化酶基因，抑制其表达的烟草腺毛中西柏三烯二醇（CBT-diol）含量降低41%，而前体物西柏三烯一醇（CBT-ol）的含量升高19%，蚜虫抗性显著增强。

2.3 糖脂合成相关基因

Chang 等[39]鉴定到一个参与烟草糖酯合成的新基因 NtALS1，NtALS1基因在烟草腺毛腺头中特异表达，其蛋白主要在叶绿体中发挥功能，NtALS1 基因敲除后，突变体中糖酯含量显著低于野生型对照，说明 NtALS1参与烟草腺毛中糖酯的合成。Feng 等[40]在本氏烟中克隆到两个糖脂酰基转移酶基因 ASAT1和 ASAT2，ASAT1敲除后本氏烟体内糖脂含量显著减低，而ASAT2敲除后完全检测不到糖脂的存在，两个敲除突变体叶片内含水量降低，叶片温度升高，蚜虫和白粉虱在敲除突变体的存活率升高，推测 ASAT1和 ASAT2在糖脂合成、抗蚜虫和抗白粉虱、以及抵御干旱胁迫中可能发挥重要作用。Chang 等[41]在普通烟草中克隆到两个酰基转移酶基因 NtASAT1/2，研究发现 NtASAT1/2参与酰基链与糖环组装，是糖脂合成的重要靶标基因。

随着相关重要靶标基因的挖掘和克隆，烟草萜烯类和糖脂类合成代谢途径逐渐被构建，为利用基因工程、基因编辑等手段创制优异品质烟草遗传材料以及利用合成生物学手段生产具有卷烟工业应用和药用价值的萜烯类物质和糖脂提供了重要的靶基因。目前萜烯类和糖脂类代谢调控相关基因的研究相对较少，随着合成代谢途径的逐步解析，其调控网络的解析是未来研究的重点。

3 烟碱类物质合成相关基因研究进展烟草生物碱是烟草中重要的次生代谢物质，主要包括烟碱、降烟碱、新烟碱和假木贼碱，具有独特的毒性和药理活性，可能在植物对草食动物和病原菌的化学防御中发挥作用[42]。烟碱是栽培烟草中含量最高的生物碱，约占总生物碱的90%以上[43]。烟碱在根部合成，经木质部运输转运后在叶片细胞的液泡中大量积累。烟碱合成代谢途径及其相关基因的研究比较明确，主要集中于烟碱合成、转运、转化和代谢方面。

3.1 烟碱合成相关基因

腐胺 N-甲基转移酶（PMT）控制着代谢从初级代谢到次级代谢的转变，是烟碱合成的关键酶。烟草中鉴定到5个NtPMT基因，NtPMT基因的表达水平与烟碱的积累显著相关， RNAi 抑制NtPMT基因表达显著降低了烟碱的含量，而新烟碱含量显著积累[44-45]。烟草 N-甲基腐胺氧化酶 MPO 同时由两个实验室独立克隆获得，MPO 催化 N-甲基腐胺形成4-甲氨基丁醚，并通过自身环化形成 N-甲基-△-1-吡咯啉阳离子，随后与提供吡啶环部分的烟酸衍生物发生缩合反应形成烟碱[46-47]。Naconsie等[48]发现 MPO 的同源基因 NtDAO1，比 MPO 有更高的 N-甲基腐胺催化效率。QPT 催化的酶促反应是烟碱合成途径中吡啶核苷酸循环途径的限速步骤。烟草中有两个 QPT 基因， QPT1和 QPT2，核苷酸同源性达94%。RNAi 抑制 QPT2基因的表达，导致烟碱水平下降10倍以上，说明 QPT2是烟碱合成途径的关键调节酶，而 QPT1基因的表达不受茉莉酸、外源伤害等诱导，可能不参与烟碱的生物合成[49-50]。类异黄酮还原酶基因 A622、A662L 和 BBL 参与了吡咯烷环和吡啶环的结合产生烟碱。 RNAi 抑制 A622和NtBBL基因的表达，转基因烟草叶片中烟碱含量均显著降低[51-53]。

遗传分析发现，烟碱合成的调控主要有两个不连锁的位点参与，分别是 NIC1和 NIC2位点[54]。通过对 nic1和 nic2低烟碱突变体研究发现，NIC1位点区域注释到7个完整的转录因子（JRE5L2、ERF199、ERF91、ERF210、ERF29、ERF16和 ERF130）以及两个缺失转录因子（ERF110和 ERF17L3△N）。进一步分析发现， ERF199过量表达能够显著提高烟碱的积累，利用CRISPR/Cas9定点突变ERF199，获得的纯合突变体 WT-T1中几乎检测不到烟碱的合成，说明 ERF199是 NIC1位点唯一的烟碱合成主效基因[55]。NIC2位点有7个 ERF 转录因子（ERF189、ERF115、ERF221、ERF104、ERF179、 ERF17、ERF168、ERF199）存在，能够激活几乎全部参与烟碱合成的结构基因，正向調控烟碱的生物合成[56]。De Boer 等[57]鉴定到一个属于 NIC2位点的 AP2/ERF 类转录因子 ORC1，受 JA 诱导调控烟碱合成。 JA 诱导的bHLH类转录因子能够增加 ORC1的活性， ORC1和bHLH类转录因子在转录后水平受 MAPKK1介导的 JA 调控的磷酸化作用。 NtMYC2是参与烟碱合成的bHLH类转录因子。 NtMYC2可以通过结合烟碱合成关键基因PMT2和 QPT2基因的启动子，激活 PMT2和 QPT2的表达，直接参与调控由茉莉酸诱导的烟碱合成。MYC2还通过与 NIC2位点的 ERF 转录因子启动子区的 GCC-box 结合，间接激活烟碱的合成[58]。Todd 等[59] 通过构建茉莉酸甲酯处理的本氏烟草cDNA 文库结合 VIGS 技术，筛选到 NbbHLH3、NbARF1、 NbbHLH1、NbbHLH2、NbERF1、NbHB1可能参与调控茉莉酸介导的烟碱合成。 NtMYB305a 通过特异识别并结合 GAG 区段中的 AT-rich 元件，调控包括 PMT 基因在内的多个尼古丁代谢通路基因的表达以及烟草植株中尼古丁的合成水平，并能够与 G-box 结合蛋白 NtMYC2a 协同调控烟草尼古丁的代谢[60]。此外，烟碱生物合成还可能受 MAPK 级联的翻译后水平调控。研究发现，MAP 激酶 JAM1可能通过调节 ERF221和 MYC2转录因子的茉莉酸依赖性转录活性来调节烟碱生物合成结构基因的表达[61]。

3.2 烟碱转运相关基因

目前鉴定到的烟碱转运蛋白基因主要有 NUP1基因和 MATE 基因，分别定位于质膜和液泡膜。烟草尼古丁吸收透性酶NUP1负责将胞质外的烟碱转运到胞质内，RNAi 抑制 NUP1表达的毛状根中烟碱含量降低，而培养液中烟碱含量显著增加，NUP1过量表达则抑制烟碱从根部到地上部的长距离运输[62-63]。进一步研究发现，NUP1位于 ERF189的上游，激活 ERF189的表达增强烟碱的生物合成，除运输烟碱外， NtNUP1还具有运输维生素 B6、吡哆醇、新烟碱的功能[64]。MATE 是一类新型二级转运蛋白基因家族，茉莉酸诱导烟碱转运蛋白基因 JAT1和 JAT2，是 MATE 家族的转运蛋白基因，定位于烟草叶片细胞的液泡膜上，可以转运烟碱及假木贼碱，对烟碱在叶片中的分布发挥重要功能[65-66]。另外两个烟碱转运蛋白基因MATE1和MATE2也在烟草中得到分离，MATE1和 MATE2蛋白也定位于烟草叶片细胞的液泡膜上，在生物碱由胞质到液泡的转运中发挥重要作用[67]。

3.3 烟碱转化相关基因

栽培烟草中烟碱在烟碱-N-去甲基化酶（NND）催化[68]作用下脱去甲基，实现烟碱向降烟碱的转化，导致烟碱含量显著降低。研究发现，去甲基化反应主要发生在成熟叶片中，并在烟叶烘烤过程中具有较高活性。烟草 CYP82E 亚族成员在参与烟碱转化中发挥重要功能。目前已有多个烟碱-N-去甲基化酶的基因得到分离和鉴定， CYP82E 亚组成员的突变体可以有效抑制烟碱的去甲基化，显著降低降烟碱含量。利用 RNAi 技术抑制 CYP82E4v1的表达，可以有效抑制衰老叶片的烟碱去甲基化，显著降低降烟碱含量[69]。进一步研究发现，过量表达亚甲基四氢叶酸还原酶 MTHFR1能够抑制 CYP82E4基因的表达，进而影响烟碱向降烟碱的转化[70]。CYP82E5v2和 CYP82E1与 CYP82E4v1具有较高同源性，但在不同组织部位中表达模式不同，主要负责非转化植株中低水平降烟碱的合成[68，71]。与普通栽培烟草不同，在林烟草和绒毛状烟草两个祖先种中，降烟碱是主要的生物碱。 Chakrabarti 等[72]从林烟草中克隆到一个 CYP82E2基因，但该基因在普通烟草中存在两个位点的突变，使其丧失了去甲基化活性，在现代普通烟草生物碱进化中发挥了关键作用。在烟草花中特异表达的 CYP82E21基因则来源于绒毛状烟草，在烟草子房中行使烟碱-N-去甲基化酶（NND）的功能，催化烟碱向降烟碱转化[73]。

4 展望

现代生物育种技术的不断融合和创新发展，正在孕育和催生新一轮农业科技与产业革命[74]。基因组学的蓬勃发展为高效挖掘利用重要性状相关优良基因提供了有效途径，在植物研究领域引发了一场世界性的“基因大战”。与此同时，随着新兴前沿技术的不断发展创新，以基因编辑、合成生物学等为代表的生物育种技术已成为国际育种的前沿和核心，正在蓬勃迅猛发展。新形势下，要重视加强种质资源的研究工作，实现新型前沿技术突破，培育烟草香气品质突破性品种。

（1）深入开展种质资源鉴定和研究工作，挖掘重要性状相关基因。

烟草种质资源类型丰富，含有大量宝贵的基因资源。不同类型烟草材料间遗传基础差异大，代谢物差异广泛，蕴含大量的品质形成关键基因，是挖掘鉴定特异代谢物及其调控基因的理想材料。特异烟草种质，特别是野生烟、药烟、香料烟、雪茄烟等与烤烟相比，往往具有独特的品质特性，蕴含大量的品质相关的代谢物和功能基因。今后应加强对特异种质的挖掘研究，整合表型组学、转录组学、代谢组学等多组学技术，开发、完善种质资源品质相关性状的精准鉴定方法，利用分子标记、基因芯片、高通量测序等技术深入开展种质资源的遗传多样性分析，加强不同类型烟草品质性状深入研究，明确差异代谢物质，挖掘解析烟草香气品质形成的关键基因或位点，解析基因功能及调控网络，为开展烟草生物育种储备大量的基因资源。

（2）整合現代分子生物学技术和多组学技术，解析代谢物合成代谢调控网络。

烟草为异源四倍体，次生代谢途径合成的结构酶基因和调控基因普遍存在基因家族扩张的情况，使烟草次生代谢物的合成代谢及调控非常复杂。目前研究较为系统的是烟碱和多酚类物质合成代谢途径，而对于萜烯类、糖脂类物质的合成及代谢通路的解析仍处于合成酶鉴定阶段，调控机制研究任重道远。整合基因组、转录组、代谢组等多组学技术，开展分子生物学、计算生物学、分析化学等多领域合作是当前品质性状重要基因挖掘研究利用的有效途径。

（3）突破新兴前沿技术，实现品质性状重要基因的精准调控。

近年来，基因编辑、合成生物学等新兴前沿技术的发展，为实现烟草精准高效的现代生物育种提供了新的技术保障。但基因编辑技术在栽培烟草和野生烟草中尚未实现突破。利用基因编辑技术和合成生物学，对品质性状关键基因进行精准高效编辑或合成，在微生物和烟草中重构次生代谢物质合成途径，能够突破传统育种技术在复杂农艺性状方面的技术瓶颈，实现烟草香气品质突破性品种的培育。

参考文献

[1] 朱小茜，徐晓燕，黄义德，等.多酚类物质对烟草品质的影响[J].安徽农业科学，2005，33（8）：1910-1911.

ZHU X Q， XU X Y， HUANG Y D， et al. Effect of polyphenols on tobacco quality[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences， 2005， 33（8）：1910-1911.

[2]  CHEN S， PAN X H， LI Y T， et al. Identification and characterization of chalcone synthase gene family members in Nicotiana tabacum[J]. Journal of Plant Growth Regulation， 2017， 36：374-384.

[3]  CHEN S， WU F Y， LI Y T， et al. NtMYB4 and NtCHS1 are critical factors in the regulation of flavonoid biosynthesis and are involved in salinity responsiveness[J]. Frontiers in Plant Science， 2019， DOI：10.3389/fpls.2019.00178.

[4]  NISHIHARA M， NAKATSUKA T， YAMAMURA S. Flavonoid components and flower color change in transgenic tobacco plants by suppression of chalcone isomerase gene[J]. FEBS Letters， 2005， 579（27）：6074-6078.

[5]  LIM S H， YOU M K， KIM D H， et al. RNAi-mediated suppression of dihydroflavonol 4-reductase in tobacco allows fine-tuning of flower color and flux through the flavonoid biosynthetic pathway[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2016， 109：482-490.

[6]  MAHAJAN M， AHUJA P S， YADAV S K. Post-transcriptional silencing of flavonol synthase mRNA in tobacco leads to fruits with arrested seed set[J]. PLoS One， 2011， 6（12）：e28315.

[7]  SHI J， LI W， GAO Y， et al. Enhanced rutin accumulation in tobacco leaves by overexpressing the NtFLS2 gene[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry， 2017， 81（9）：1721-1725.

[8]  WANG Z， WANG S， WU M， et al. Evolutionary and functional analyses of the 2-oxoglutarate-dependent dioxygenase genes involved in the flavonoid biosynthesis pathway in tobacco[J]. Planta， 2019， 249（2）：543-556.

[9]  JIAO F， ZHAO L， WU X， et al. Metabolome and transcriptome analyses of the molecular mechanisms of flower color mutation in tobacco[J]. BMC Genomics， 2020， 21（1）：611.

[10] ZHENG Y， CHEN Y， LIU Z， et al. Important roles of key genes and transcription factors in flower color differences of Nicotiana alata[J]. Genes （Basel）， 2021， 12（12）：1976.

[11] TAGUCHI G， SHITCHI Y， SHIRASAWA S， et al. Molecular cloning， characterization， and downregulation of an acyltransferase that catalyzes the malonylation of flavonoid and naphthol glucosides in tobacco cells[J]. Plant Journal， 2005， 42（4）：481-91.

[12] 賈宏防，张洪映，张松涛，等.不同生态区烤烟黄酮类物质代谢途径关键基因表达分析[J].河南农业科学，2014，43（5）：52-55.

JIA H F， ZHANG H Y， ZHANG S T， et al. Expression analysis of key genes in flavonoid metabolism pathway of tobacco in different ecological zones[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences， 2014， 43（5）：52-55.

[13] YANG C Q， FANG X， WU X M， et al. Transcriptional regulation of plant secondary metabolism[J]. Journal of Integrative Plant Biology， 2012， 54（10）：703-712.

[14] DUBOS C， STRACKE R， GROTEWOLD E， et al. MYB transcription factors in Arabidopsis[J]. Trends in Plant Science，2010， 15（10）：573-581.

[15] PATTANAIK S， KONG Q， ZAITLIN D， et al. Isolation and functional characterization of a floral tissue-specific R2R3 MYB regulator from tobacco[J]. Planta， 2010（5）：1061-1076.

[16] BAI Y，PATTANAIK S，PATRA B， et al. Flavonoid-related basic helix-loop-helix regulators， NtAn1a and NtAn1b， of tobacco have originated from two ancestors and are functionally active[J].Planta， 2011（2）：363-375.

[17] WANG Z， LI Z F， WANG S S， et al. NtMYB12a acts downstream of sucrose to inhibit fatty acid accumulation by targeting lipoxygenase and SFAR genes in tobacco[J]. Plant Cell and Environment， 2021， 44（3）：775-791.

[18] LI P， CHEN X， SUN F， et al.Tobacco TTG2 and ARF8 function concomitantly to control flower colouring by regulating anthocyanin synthesis genes[J]. Plant Biology （Stuttg）， 2017， 19（4）：525-532.

[19] WANG Z， LUO Z， LIU Y， et al.Molecular cloning and functional characterization of NtWRKY11b in promoting the biosynthesis of flavonols in Nicotiana tabacum[J]. Plant Science， 2021， 304：110799.

[20] WANG Z， WANG S B， LIU P P， et al. Molecular cloning and functional characterization of NtWRKY41a in the biosynthesis ofphenylpropanoids in Nicotiana tabacum[J]. Plant Science， 2022， 315：111154.

[21] WANG W， LIU G， NIU H， et al.The F-box protein COI1 functions upstream of MYB305 to regulate primary carbohydrate metabolism in tobacco （Nicotiana  tabacum L. cv. TN90）[J]. Journal of ExperimentalBotany， 2014， 65（8）：2147-2160.

[22] ZHANG X， GOU M， and LIU C J. Arabidopsis Kelch repeat F-boxproteins regulate phenylpropanoid biosynthesis via controlling the turnover of phenylalanine ammonia-lyase[J]. Plant Cell， 2013， 25：4994-5010.

[23] ZHANG X， GOU M， GUO C， et al. Downregulation of Kelchdomain-containing F-box protein in Arabidopsis enhances the production of （poly）phenols and tolerance to ultraviolet radiation[J].Plant Physiology， 2015， 167：337-350.

[24] ZHANG X， ABRAHAN C， COLQUHOUN T A， et al. A proteolytic regulator controlling chalcone synthase stability and flavonoid biosynthesis in Arabidopsis[J]. Plant Cell， 2017， 29（5）：1157-1174.

[25] 邸慧慧，史宏志，张大纯.烟草叶片腺毛及其分泌物研究進展[J].贵州农业科学，2009，37（8）：61-64.

DI H H， SHI H Z， ZHANG D C. Research progress on glandular hair and glandular hair secretion of tobacco leaves[J]. Guizhou Agricultural Science， 2009， 37（8）：61-64.

[26] 张华.烟草腺毛形态、结构及基因表达谱研究[D].郑州：河南农业大学，2009.

ZHANG H. Morphology， ultra structure and gene expression profiles studies of tobacco leaf trichome[D]. Zhengzhou： Henan AgriculturalUniversity， 2009.

[27] LIU Y， LIU D， KHAN A R， et al. NbGIS regulates glandular trichome initiation through GA signaling in tobacco[J]. Plant Molecular Biology， 2018， 98（1-2）：153-167.

[28] MA Y Q， LI Q， PU Z Q， et al. Constitutive expression of NtabSPL6-1 in tobacco and Arabidopsis could change the structure of leaves and promote the development of trichomes[J]. Journal of Plant Physiology， 2019， 240：152991.

[29] WU M L， CUI Y C， GE L， et al.NbCycB2 represses Nbwo activity via a negative feedback loop in tobacco trichome development[J]. Journal of Experimental Botany， 2020， 71（6）：1815-1827.

[30] CHOI Y E， LIM S， KIM H J， et al. Tobacco NtLTP1， a glandular-specific lipid transfer protein， is required for lipid secretion from glandular trichomes[J]. Plant Journal， 2012， 70（3）：480-491.

[31] WANG Z， YAN X， ZHANG H， et al.NtCycB2 negatively regulates tobacco glandular trichome formation， exudate accumulation， and aphid resistance[J]. Plant Molecular Biology， 2022， 108（1-2）：65-76.

[32] ZHANG H， LU X， WANG Z， et al.Excretion from long glandular trichomes contributes to alleviation of cadmium toxicity in Nicotiana tabacum[J]. Environmental Pollution， 2021， 285：117184.

[33] WANG E， GAN S， WAGNER G J. Isolation and characterization of the CYP71D16 trichome-specific promoter from Nicotiana tabacum L.[J]. Journal of Experimental Botany， 2002， 53（376）：1891-1897.

[34] POTTIER M， LATERRE R， VAN WESSEM A， et al.Identification of two new trichome-specific promoters of Nicotiana tabacum[J]. Planta， 2020， 251（3）：58.

[35] SALLAUD C， GIACALONE C， TOPFER R， et al. Characterization of two genes for the biosynthesis of the labdane diterpene Z-abienol in tobacco （Nicotiana tabacum） glandular trichomes[J]. Plant Journal， 2012， 72（1）：1-17.

[36] 王国平，刘旦，李洋洋，等.烟草冷杉醇合成关键基因 NtCPS2的 SNP 功能标记开发与应用[J].分子植物育种，2020，18（24）：8178-8186.

WANG G P， LIU D， LI Y Y， et al. Development and application of SNP functional markers of NtCPS2， a key gene for cis-abienol synthesis in tobacco [J]. Molecular Plant Breeding， 2020， 18（24）：8178-8186.

[37] HE L， LIU H， CHENG C， et al. RNA sequencing reveals transcriptomic changes in tobacco （Nicotiana tabacum） following NtCPS2 knockdown[J]. BMC Genomics， 2021， 22（1）：467.

[38] WANG E， WANG R， DEPARASIS J， et al. Suppression of a P450hydroxylase  gene  in  plant  trichome  glands  enhances natural-product-based aphid resistance[J]. Nature Biotechnology， 2001， 19：371-374.

[39] CHANG A X， CHEN B， YANG A G， et al. The trichome-specificacetolactate synthase NtALS1 gene， is involved in acylsugar biosynthesis in tobacco （Nicotiana tabacum L.）[J]. Planta， 2020，252（1）：13.

[40] FENG H L， ACOSTA-GAMBOA L， KRUSE L H， et al. Acylsugarsprotect Nicotiana benthamiana against insect herbivory and desiccation[J]. Plant Molecular Biology， 2021. doi：10.1007/s11103-021-01191-3.

[41] CHANG A X， HU Z Y， CHEN B， et al. Characterization of trichome-specific BAHD acyltransferases involved in acylsugar biosynthesis in Nicotiana tabacum[J]. Journal of Experimental Botany， 2022， 73（12）：3913-3928.

[42] STEPPUHN A， GASE K， KROCK B， et al. Nicotine's defensivefunction in nature[J]. PLoS Biology， 2004， 2：1074-1080.

[43] 史宏志，黃元炯，刘国顺，等.我国烟草和卷烟生物碱含量和组成比例分析[J].中国烟草学报，2001，7（2）：8-12.

SHI H Z， HUANG Y J， LIU G S， et al. Analysis of alkaloid contentand composition ratio of tobacco and cigarette in China[J].ActaTabacariaSinica， 2001， 7（2）：8-12.

[44] RIECHERS D E， TIMKO M P. Structure and expression of the gene family encoding putrescine N-methyltransferase in Nicotiana tabacum： new clues to the evolutionary origin of cultivated tobacco[J]. Plant Molecular Biology， 1999， 41（3）：387-401.

[45] WANG P， ZENG J， LIANG Z F， et al. Silencing of PMT expressioncaused a surge of anatabine accumulation in tobacco[J]. Molecular Biology Reports， 2009， 36（8）：2285-2289.

[46] HEIM W G， SYKES K A， HILDRETH S B， et al. Cloning andcharacterization of a Nicotiana tabacum methylputrescine oxidase transcript[J]. Phytochemistry， 2007， 68：454-463.

[47] KATOH A， SHOJI T， HASHIMOTO T. Molecular cloning ofN-methylputrescine oxidase from tobacco[J]. Plant and CellPhysiology， 2007， 48：550-554.

[48] NACONSIEM，KATOK， SHOJI T， et al. Molecular evolution of N-methylputrescine oxidase in tobacco[J]. Plant and Cell Physiology，2014， 55（2）：436-444.

[49] SINCLAIR S J， MURPHY K J， BIRCH C D， et al. Molecular characterization of quinolinatephosphoribosyltransferase （QPRtase） in Nicotiana[J]. Plant Molecular Biology， 2000， 44（5）：603-617.

[50] KHAN S， PANDEY S S， JYOTSHNA， et al. Cloning and functional characterization of quinolinic acid phosphoribosyl transferase （QPT） gene of Nicotiana tabacum[J]. Physiologia Plantarum， 2017， 160（3）：253-265.

[51] DEBOER K D， LYE J C， AITKEN C D， et al.The A622 gene in Nicotiana glauca （tree tobacco）： evidence for a functional role in pyridine alkaloid synthesis[J]. Plant Molecular Biology， 2009， 69（3）：299-312.

[52] KAJIKAWA M， HIRAI N， HASHIMOTO T. A PIP-family protein is required for biosynthesis of tobacco alkaloids[J]. Plant Molecular Biology， 2009， 69（3）：287-298.

[53] LEWIS R S， LOPEZ H O， BOWENS W， et al. Transgenic and mutation-based suppression of a berberine bridge enzyme-like （BBL） gene family reduces alkaloid content in field-grown tobacco[J]. PLoS One， 2015， 10（2）： e0117273.

[54] HIBI N， HIGASHIGUCHI S， HASHIMOTO T， et al. Gene expression in tobacco low-nicotine mutants[J]. Plant Cell， 1994， 6：723-735.

[55] QIN Q， HUMPHRY M， GILLES T， et al.NIC1 cloning and gene editing generates low-nicotine tobacco plants[J]. Plant Biotechnology Journal， 2021， 19（11）：2150-2152.

[56] SHOJI T， INAI K， YAZAKI Y， et al. Multidrug and toxic compound extrusion-type transporters implicated in vacuolar sequestration of nicotine in tobacco roots[J]. Plant Physiology， 2009， 149（2）：708-718.

[57] DE  BOER  K，  TILLEMAN  S，  PAUWELS  L，  et  al. APETALA2/ETHYLENE RESPONSE FACTOR  and basic helix-loop-helix tobacco transcription factors cooperatively mediate jasmonate-elicited nicotine biosynthesis[J]. Plant Journal， 2011， 66（6）：1053-1065.

[58] SHOJI  T，  HASHIMOTO  T. Tobacco  MYC2 regulates jasmonate-inducible nicotine biosynthesis genes directly and by way of the NIC2-locus ERF genes[J]. Plant and Cell Physiology， 2011， 52（6）：1117-1130.

[59] TODD A T， LIU E， POLVI S L， et al. A functional genomics screen identifies diverse transcription factors that regulate alkaloid biosynthesis in Nicotiana benthamiana[J]. Plant Journal， 2010， 62（4）：589-600.

[60] BIANS Q， SUI X Y， WANG J H， et al. NtMYB305a binds to thejasmonate-responsive GAG region of NtPMT1a promoter to regulatenicotine biosynthesis[J]. Plant Physiology， 2022， 188（1）：151-166.

[61] DEWEY R E， XIE J.Molecular genetics of alkaloid biosynthesis in Nicotiana tabacum[J]. Phytochemistry， 2013， 94：10-27.

[62] HILDRETH S B， GEHMAN E A， YANG H B， et al. Tobacco nicotineuptake permease （NUP1） affects alkaloid metabolism[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2011， 108：18179-18184.

[63] KATO K， SHOJI T， HASHIMOTO T. Tobacco nicotine uptake permease regulates the expression of a key transcription factor gene in the nicotine biosynthesis pathway[J]. Plant Physiology， 2014， 166（4）：2195-204.

[64] KATO K， SHITAN N， SHOJI T， et al.Tobacco NUP1 transports both tobacco alkaloids and vitamin B6[J]. Phytochemistry， 2015， 113：33-40.

[65] MORITA M， SHITAN N， SAWADA K， et al. Vacuolar transport of nicotine is mediated by a multidrug and toxic compound extrusion （MATE） transporter in Nicotiana tabacum[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2009， 106（7）：2447-2452.

[66] SHITAN N， HAYASHIDA M， YAZAKI K. Translocation and accumulation of nicotine via distinct spatio-temporal regulation of nicotine transporters in Nicotiana tabacum[J]. Plant Signaling & Behavior， 2015， 10（7）： e1035852.

[67] SHOJI T， INAI K， YAZAKI Y， et al. Multidrug and toxic compound extrusion-type transporters implicated in vacuolar sequestration of nicotine in tobacco roots[J]. Plant Physiology， 2009， 149：708-718.

[68] GAVILANO L B， SIMINSZKY B. Isolation and characterization of the cytochrome P450 gene CYP82E5v2 that mediates nicotine tonornicotine conversion in the green leaves of tobacco[J]. Plant and Cell Physiology， 2007， 48：1567-1574.

[69] SIMINSZKY B， GAVILANO L， BOWEN S W， et al. Conversion ofnicotine to nornicotine in Nicotiana tabacum is mediated by CYP82E4， a cytochrome P450 monooxygenase[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2005， 102（41）：14919-14924.

[70] HUNG C Y， FAN L， KITTUR F S， et al. Alteration of the alkaloidprofile in genetically modified tobacco reveals a role of methylenetetrahydrofolate reductase in nicotine N-demethylation[J]. Plant Physiology， 2013， 161：1049-1060.

[71] LEWIS R S， BOWEN S W， KEOGH M R， et al. Three nicotinedemethylase genes mediate nornicotine biosynthesis in Nicotiana tabacum L.： functional characterization of the CYP82E10 gene[J]. Phytochemistry， 2010， 71：1988-1998.

[72] CHAKRABARTI M， MEEKINS K M， GAVILANO L B， et al.Inactivation of the cytochrome P450 gene CYP82E2 by degenerative mutations was a key event in the evolution of the alkaloid profile of modern tobacco[J]. New Phytologist， 2007， 175：565-574.

[73] LIEDSCHULTE V， SCHWAAR J D， LAPARRA H， et al. Identification of CYP82E21 as a functional nicotine N-demethylase in tobacco flowers[J]. Phytochemistry.2016， 131：9-16.

[74] 林敏.農业生物育种技术的发展历程及产业化对策[J].生物技术进展，2021，11（4）：405-417.

LIN  M.The  development  course  and  industrialization countermeasure of agricultural biological breeding technology[J]. Current Biotechnology， 2021， 11（4）：405-417.