网络药理学联合GEO数据挖掘与分子对接探究桔梗-鱼腥草治疗非小细胞肺癌的作用机制

李永顺，谢嘉嘉，周继红，张立，陈树超，欧阳子琛

1. 广州中医药大学第七临床医学院，广东 深圳 518133

2. 深圳市宝安区中医院肺病科，广东 深圳 518133

肺癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，在2021 年全球癌症统计中，肺癌仍是死亡人数最多的癌症，在所有恶性肿瘤死亡病例中，约1/4 是肺癌导致的[1]，而非小细胞肺癌（NSCLC）约占所有肺癌的75%[2]。虽然目前肺癌的治疗手段日益增多，包括手术切除、靶向治疗、免疫治疗、化疗等，但治疗效果仍不尽人意，5 年生存率极低[3]。

肺癌归属于中医肺积范畴，现代医家多认为其病因病机与湿、毒、痰、瘀等相关[4]。桔梗为常见药食两用的药材，味辛、苦，性平，归肺经，具有宣肺祛痰、利咽排脓的功效[5]，临床多用于治疗肺系疾病。现代药理研究发现桔梗相关成分可以有效抑制肺癌细胞的生长增殖并诱导其凋亡[6]。鱼腥草味辛，微寒，归肺经，具有清热解毒、消痈排脓的功效[5]，为治疗肺系疾病的常用药物之一。现代药理研究发现，鱼腥草及其活性成分对多种肿瘤细胞的生长增殖有抑制作用[7]，可以明显降低苯并芘诱导的DNA损伤及炎症反应，从而预防肺癌的发生发展，并且推断鱼腥草可能是预防及治疗肺癌的有效候选药剂[8]。临床上使用桔梗-鱼腥草配伍治疗NSCLC 疗效颇佳[9-10]。但目前尚无关于桔梗-鱼腥草治疗NSCLC的机制研究。本研究通过网络药理学联合GEO 数据挖掘以及分子对接技术探究桔梗-鱼腥草药对治疗NSCLC 的抗肿瘤成分及作用机制，为后续的临床应用和药物研究提供思路。

1 方法

1.1 搜集桔梗-鱼腥草活性成分与作用靶点在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）http：//tcmspw.com./tcmsp.php[11]以桔梗、鱼腥草为关键词检索相关化学成分，以口服利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18 作为活性成分的筛选标准[12-13]，提取筛选出的活性成分及活性成分对应的药物作用靶点。最后使用Uniport 蛋白数据库http：//www.uniprot.org/[14]将药物作用靶点名称统一转换为基因名。

1.2 NSCLC 数据集的获取及差异分析在GEO 数据库（http：//www.ncbi.nim.nih.gov/geo/）检索NSCLC 相关数据集，以样本量大于20，同时包含正常样本和疾病样本作为筛选条件，并对数据集进行质量控制和主成分分析，保证得到的数据集可用于差异分析。随后使用R 软件对筛选得到的数据集进行归一化处理及差异分析，以|log2FC|≥1，adj.P＜0.05 为筛选标准得到差异表达基因（DEGs）。

1.3 NSCLC 相关靶点和药物-疾病共同靶点的获取在GenCards 数据库（http：//www.genecards.org/）[15]和OMIM 数据库（https：//www.omim.org/）以“Non-Small Cell Lung Cancer”为检索词搜集NSCLC 已证实的靶点[16]，并与差异表达基因合并，得到尽可能多的疾病相关靶点。再利用韦恩图工具对药物作用靶点和疾病相关靶点取交集得到药物-疾病共同靶点。

1.4 药物-活性成分-靶点网络构建将桔梗-鱼腥草、活性成分以及药物-疾病共同靶点三者对应信息导入Cytoscape3.9.0 软件进行网络构建，并对网络的拓扑属性进行分析，利用网络拓扑属性筛选出“核心成分”，一般来说度值越大的节点在网络中重要程度越大[17]。

1.5 靶点网络构建及核心靶点筛选将药物-疾病共同靶点导入String 平台（https：//cn.string-db.org/）进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析[18]，并将结果导入Cytoscape3.9.0 软件进行可视化和网络拓扑分析，通过度值大小筛选出“核心靶点”。

1.6 GO及KEGG富集分析将共同靶点导入Metascape数据库（http：//metascape.org/），进行基因本体（GO）中的生物过程（BP）、细胞成分（CC）及分子功能（MF）3 类富集分析和KEGG 通路富集分析。然后使用微生信在线工具（http：//www.bioinformatics.com.cn）对结果进行可视化分析。

1.7 分子对接验证将PPI 网络和药物-活性成分-疾病网络选取出的核心靶点与核心成分进行分子对接。在PDB 数据库（http：//www.rcsb.org/）[19]下载核心靶点的3D 结构，并通过PyMol 软件对其进行预处理。从PubChem 数据库下载核心成分的SDF 格式文件并转化为PDB 格式。最后使用AutoDock 软件将核心成分和核心靶点蛋白进行分子对接，根据结合能大小判断结合强度，小于-5.0 kcal/mol 表示配体和受体有较好的结合力，小于-8.0 kcal/mol 表示有强烈的结合力[20]。最后使用PyMol 软件对结合能＜-8.0 kcal/mol的结果进行可视化。

2 结果

2.1 桔梗-鱼腥草化学成分及作用靶点见表1。通过TCMSP 数据库筛选出药物活性成分7 个，作用靶点176 个，其中桔梗活性成分4 个，鱼腥草活性成分3 个，活性成分包括槲皮素、木犀草素、金合欢素、菠菜甾醇、异索马酮、山奈酚和顺式-二氢槲皮素。

表1 桔梗-鱼腥草药对活性成分

2.2 数据集差异分析见图1。筛选得到GSE27262数据集，其包含25 例正常肺组织样本和25 例NSCLC 肺组织样本。运用R 语言对GSE27262 数据集进行质量控制，选择其中的RLE 箱线图进行展示（图1a），结果表明：GSE27262 数据集芯片间具有较好的一致性，可以用于进行差异基因分析。主成分分析显示NSCLC 组和正常对照组，组内距离较近，组间距离较远，2 组样本间无明显交集，有较好的可比性（图1b）。同时为去除各样本间批次效应，进行差异分析前对数据集进行归一化处理（图1c 为归一化前，图1d 为归一化后）。最终差异分析一共获得1 860 个DEGs，其中744 个上调基因，1 116 个下调基因，并绘制火山图（图1e）和热图（图1f）。

图1 GSE27262 数据集差异分析

2.3 NSCLC 疾病相关靶点与药物-疾病共同靶点见图2。在GenCards 数据库共收集到NSCLC 相关靶点5 803 个，通过“Reverance.score≥10”筛选有4 024 个。OMIM 数据库获得656 个靶点。二者与差异表达基因合并，删除重复值，共得到疾病靶点4 783 个，再与药物作用靶点取交集得到139 个桔梗-鱼腥草治疗NSCLC 的潜在靶点。

图2 桔梗-鱼腥草与NSCLC 共同靶点韦恩图

2.4 药物-成分-靶点网络分析见表2、图3。运用Cytoscape3.9.0 软件构建药物-活性成分-靶点网络图。网络中度值越高则节点越大颜色越深。选取度值前3 的活性成分作为核心成分，分别为：槲皮素、木犀草素、山奈酚，其中槲皮素可作用于85 个靶点，网络度最好。

表2 桔梗-鱼腥草活性成分网络度

2.5 PPI 网络分析见图4。通过String 平台构建药物-疾病共同靶点PPI 网络，利用Cytoscape 3.9.0 软件进行可视化和网络拓扑分析。网络中节点度值越大，其形状越大颜色越蓝，在网络中的作用越重要，最为可能是桔梗-鱼腥草治疗NSCLC 的核心靶点。选取度值前5 的作为核心靶点，分别为：TP53、AKT1、JUN、TNF、EGFR，其中TP53 的度值最高。

图4 桔梗-鱼腥草与NSCLC 共同靶点PPI 网络

2.6 GO 功能富集分析见图5。将桔梗-鱼腥草与NSCLC 的139 个共同靶点使用Metascape 进行GO 富集的BP、CC 和MF 3 种分析，共得到2 281 条相关条目，其中生物过程（BP）条目2 044 个，分子功能（MF）条目157 个，细胞组成（CC）条目80 个。根据P＜0.01，取排名前10 位的富集条目进行展示。分析发现其生物过程主要包括：细胞凋亡、细胞死亡正向调控、细胞群增殖负向调控、对创伤的反应、对脂多糖的反应等。分子功能主要包括：转录因子合成、蛋白激酶合成、蛋白同质化活性、细胞因子受体结合、核受体活性、激酶调节器活性、蛋白激酶活性、丝氨酸水解酶活性等。细胞组成主要包括：膜筏、囊泡腔、细胞外基质、细胞器外膜、受体复合物、蛋白激酶复合物、转录调节器复合体等。

图5 GO 富集分析

2.7 KEGG 富集分析见表3、图6。通过Metascape数据库对药物-疾病共同靶点进行KEGG 分析，以P＜0.05 作为筛选标准得到326 条信号通路。选取富集程度最高的10 条通路，进行气泡图展示。

图6 KEGG 信号通路富集分析

表3 药物-疾病靶点KEGG 信号通路富集分析

2.8 分子对接结果见表4、图7。将选取的核心成分与核心靶点进行分子对接，结果显示结合能均小于0。使用PyMol 软件，选择结合能＜-8.0 kcal/mol的结果进行可视化。

图7 分子对接结果图

表4 核心成分与核心靶点分子对接亲和力kcal/mol

3 讨论

本研究通过构建药物-活性成分-靶点网络图，得到桔梗-鱼腥草核心成分：槲皮素、木犀草素、山奈酚。有研究发现槲皮素能够下调SRC 基因的表达，从而阻断Fn4/NF-kappaB 信号通路，减少NSCLC 的增殖和转移[21]。李华洋等[22]发现槲皮素可能通过抑制STAT3 信号通路，从而发挥抑制肺腺癌A549 细胞增殖、迁移和侵袭能力。木犀草素能够诱导细胞凋亡，起到抑制NSCLC A549 细胞增殖、侵袭及迁移的作用[23]；并通过调节肌钙蛋白表达，收缩细胞骨架逆转EMT[24]。山奈酚又称山奈素，具有抗癌、抗病毒、抗炎和抗氧化等多种药理作用[25-26]。研究表明，山奈酚同样有降低NSCLC 细胞增殖、侵袭及迁移的能力，可能与调控ERRα、miR21 等机制有关[27-28]。

通过桔梗-鱼腥草与NSCLC 靶点互作网络分析得知，桔梗-鱼腥草治疗NSCLC 的潜在核心靶点包括肿瘤坏死蛋白53（TP53）、蛋白激酶1（AKT1）、转录因子AP-1（JUN）、肿瘤坏死因子（TNF）、表皮生长因子受体（EGFR）。TP53 是目前研究最为透彻的癌症相关基因之一，以抑癌作用而闻名，具有诱导细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成和肿瘤细胞增殖的作用[29]。发现约50%的癌症患者有TP53 突变，导致其功能从抑癌向促癌转变，从而促进癌细胞的增殖和迁移[30-31]。另外突变的TP53 相关基因的表达与患者预后有关，基因表达水平越高，患者预后越差[32]。AKT 又称蛋白激酶B，是PI3K-AKT 通路的下游靶蛋白，参与调控细胞的生长、代谢和凋亡，对肿瘤细胞的生长、增殖以及迁移至关重要[33]。约一半以上的NSCLC 患者存在激活状态AKT 高表达，其表达程度越高，疾病预后越差[34]。AKT1 属于AKT 激酶家族，相关研究表明AKT1 不仅能够降低NSCLC 对化疗药物的敏感性，还能促进EGFR 和K-RAS 突变的NSCLC 细胞的侵袭及迁移[34]。

GO 富集分析显示，桔梗-鱼腥草治疗NSCLC 的生物过程主要涉及细胞凋亡、细胞死亡正向调控、细胞群增殖负向调控等；分子功能包括转录因子合成、蛋白激酶合成、丝氨酸水解酶活性等；细胞组成主要包括：受体复合物、蛋白激酶复合物、转录调节器复合体等。KEGG 分析显示，桔梗-鱼腥草可能通过癌症、MAPK 和PI3K-AKT 等信号通路发挥抗NSCLC 的作用。其中PI3K-AKT 信号通路是NSCLC最重要的调控途径之一，其涉及癌细胞的生长、增殖、侵袭和迁移，能减缓癌症细胞凋亡、促进血管生成以及增加化疗耐药等[35]。

本研究通过网络药理学联合GEO 数据挖掘得到桔梗-鱼腥草治疗NSCLC 的潜在核心成分和核心靶点，并分析得到可能的作用途径。表明桔梗-鱼腥草治疗NSCLC 是多成分、多靶点、多通路协同作用的复杂网络机制。同时分子对接结果表明核心成分和核心靶点对接良好，进一步验证推论的合理性。为NSCLC 的临床治疗和后续实验研究提供一定参考。