全癌标志物：40年的探索发现之旅

于文强

2023年4月28日，全癌标志物在尿路上皮癌检测中的应用获得美国食品和药物管理局（FDA）突破性医疗器械认证。这是我从2013年首次发现全癌标志物以来最开心的一天，这十年间每当我在不同场合讲解全癌标志物时，面对别人疑惑的表情以及各种灵魂拷问，我像一个做错事的小孩。我清楚地知道发再多的文章，做再多的宣讲，不如用全癌标志物解决一个临床实际问题，用临床真实鲜活的案例来证明一切！我不再纠结于别人是否相信全癌标志物，我要做的是找到更多的合作者，让全癌标志物得到更多的应用。回想起全癌标志物的发现和我的探索历程，不禁感慨万千：看过去，云卷云舒；看未来，风轻云淡；自古寻常事，谈笑一挥间！

时光倒回40年

1983年，我还是陕西鄠县的一个农家小伙，背着行囊走向心中神往的第四军医大学；而在地球的另一边，肿瘤甲基化研究也缓缓掀开序幕。约翰·霍普金斯大学医学院的范伯格（A. Feinberg）教授在《自然》（Nature）杂志发表文章，在肿瘤样本中意外发现了全基因组的DNA低甲基化现象，第一次将DNA甲基化和肿瘤联系起来，开创了DNA甲基化在肿瘤研究领域的先河[1]。

1984年，约翰·霍普金斯大学的拜林（S. Baylin）教授发现抑癌基因的启动子区域存在高甲基化现象，并提示该区域的高甲基化是导致抑癌基因在肿瘤中沉默的重要原因。此后，启动子区域高甲基化理论在肿瘤甲基化研究领域占据主导地位，而范伯格发现的肿瘤存在全基因组DNA低甲基化现象则被束之高阁。全基因组是低甲基化还是局部的高甲基化，到底哪个理论更接近真理？直到1998年，范伯格发表文章，揭示了全基因组DNA低甲基化导致基因组的不稳定，进而参与肿瘤的发生。其实，他们的研究结果都是对的，肿瘤的发生中既存在局部区域的高甲基化，也存在全基因组范围的低甲基化。科學就是这样有趣，在百家争鸣中发展，在百花齐放中进步。

一边是火焰，一边是海水

肿瘤DNA甲基化研究已经走过40个年头，然而DNA甲基化研究和甲基化的应用可以说是冰火两重天。火焰是指在实验室或者特定条件下，DNA甲基化检测能够获得很好的检测效率和漂亮的研究数据，研究者的热情和信心像火焰一样；而在临床应用端，甲基化检测与临床的符合率却比较低，就像浇在头顶上的一盆盆冰冷的海水。好在DNA甲基化研究领域还有一位标杆性人物，他就是美国南加州大学的琼斯（P. Jones）教授，他将DNA甲基化酶抑制剂作为药物用于骨髓增生异常综合征的临床治疗，取得了不错的效果。同时，琼斯也是Septin9的发现者，可以说他的研究成果一定程度缓解了DNA甲基化在肿瘤应用研究方面的尴尬。

千里之行，始于足下

从1983年进入大学，我花了6年时间拿到了医学本科学位，毕业后留在西京医院血液科从事临床工作，主要是白血病的诊断与治疗。从1989年到2001年，我的主业是一名临床医生，工作期间拿到了硕士和博士学位。可是，已经博士毕业的我常常陷入苦恼，当时的诊疗手段对血液肿瘤患者常常毫无办法，只能看着患者的生命逐渐枯萎。我不甘心就这样束手无策，现有的医疗技术没有办法解决问题，我就去探索新的方法！怀着这样的心情，我以36岁的“高龄”走上了出国留学的道路。

2001年11月，我师从瑞典乌普萨拉大学的奥尔松（R. Ohlsson）教授，就此阴差阳错地踏入表观遗传学领域。彼时还没多少人知道表观遗传学（Epigenetics）。我在瑞典的实验室从事ChIP-on-Chip [将染色质免疫共沉淀技术（ChIP）及与芯片方法（chip）结合，是一种研究体内DNA与蛋白质相互作用的高通量技术。]的应用研究，用于寻找CTCF（广泛存在于真核生物中的多功能转录因子）的基因结合靶位点。我们成功地将ChIPon-Chip技术用于CTCF靶位点的寻找，之后我们尝试做MeDIP（methylated DNA immunoprecipitation），就是用甲基化的抗体来富集甲基化区域[2]。

如何更好地将DNA甲基化应用于肿瘤的诊断、治疗和预后判断，成为DNA甲基化研究领域的重要问题。之后，找出其中的关键环节就成了我的目标。

时光倒回20年

论如何做一个出色的 “科学杀手”

2003年底，我离开乌普萨拉大学来到约翰·霍普金斯大学范伯格的实验室做博士后，继续从事表观遗传学研究。作为DNA甲基化研究奠基人的范伯格，招收学生是极其严苛的，我在瑞典实验室相关的研究结果和掌握的实验技术，为我后续在范伯格的实验室继续从事表观遗传学研究打下了良好的基础。

还记得进入实验室后，第一次和范伯格交流时，他问了我一个问题：一个出色的士兵在战场上该如何杀死对手？他说你可以用刀，也可以用枪，你可以打伤他的胳膊或大腿，让敌人流血而死；而一个优秀的士兵应该直击对手要害，快速致对手于死地。稍后，他又一本正经地告诉我，慢悠悠地杀死对手的方式就让别人去做吧，我们要做的事情，就是一刀毙命！看到我惊讶的表情，他说你慢慢会懂得做事情的正确方式。我惊讶于他的直截了当，他用一个非常简单而又非同寻常的方式告诉我，每一个人的时间都是有限的，我们要做科学领域最重要的事情，解决最关键的问题。

博观而约取，厚积而薄发

我在范伯格的实验室继续从事DNA甲基化相关的工作。一方面，我想优化经重亚硫酸盐处理的DNA甲基化检测方法和方案；另一方面，我希望能够使用其他化学试剂代替重亚硫酸盐处理进行DNA甲基化检测。焦磷酸测序是DNA甲基化定量检测的金标准，当时焦磷酸测序仪开始被投放用于DNA甲基化检测，范伯格的实验室就有一台在试用，许多DNA甲基化检测的方案和方法的优化也在这里完成，我们在DNA甲基化检测领域做了非常多的方法学的优化工作。同时，我也尝试解决一些肿瘤DNA甲基化领域重要的科学问题。我们发现P15基因区的反义核酸是诱导DNA甲基化最重要的原因，揭示了P15基因的甲基化是如何发生的，以及它在白血病发生过程中是如何被沉默的[3]。我在范伯格实验室学到的最重要的东西就是先解决问题，再发表文章。如果要解决问题，就要解决最关键的科学问题。

时光倒回15年

看似寻常最奇崛，成如容易却艰辛

2008年初，我回到复旦大学任教，继续从事表观遗传学研究。我以首席科学家的身份领衔了表观遗传学领域的第三个973项目“染色质解码的基础及医学应用基础研究”，着手解决一些DNA甲基化领域的关键问题。但是，我发现了一个不容忽视的问题，国外表观遗传学领域的研究进展非常快，而国内大多数从本科进入研究生阶段的学生，表观遗传学的相关理论和实验技能都非常欠缺。如果我们对表观遗传学领域的一个热点感兴趣，等我们深入探究、得出成果起码得5年以后，到那时这些研究成果可能早就被其他人发表了。所以，我定下规矩，我们实验室的研究绝不跟着热点走。我们要么做别人不做的问题，要么将别人做不到的方法、技术进行优化。只有这样，我们才能超越别人。同時，作为一名临床医生出身的科研工作者，我们必须从解决问题入手，解决临床的问题，解决医生的问题。

千淘万漉虽辛苦，吹尽狂沙始到金

2010年，二代测序刚刚兴起，我想找一些线粒体DNA甲基化方面的资料，发现居然没有线粒体DNA甲基化的图谱。后来我才明白，当时的甲基化检测技术对于全基因组甲基化位点的覆盖远远不足。人体大约有2800万个CG位点，常用的450K芯片仅能覆盖约1%的CG位点。之后出现的全基因组甲基化测序（WGBS），其测序数据的有效利用率也仅在50%左右。为什么WGBS技术会造成如此高比例的数据浪费？因为WGBS技术使用重亚硫酸盐处理DNA片段，造成基因组的复杂度大幅下降，导致检测信息丢失。针对重亚硫酸盐处理导致的比对率降低的技术瓶颈，我们研发了不降低基因组复杂度的全新的全基因组 DNA 甲基化测序技术GPS （guide positioning sequencing），即“导航定位测序”[4]。GPS技术可以覆盖全基因组96%的胞嘧啶（C），基于该DNA甲基化检测方案，我们绘制出迄今为止覆盖率最高的全基因组DNA甲基化图谱。尤其是在比较正常细胞和肿瘤细胞的甲基化差异位点时，我们可以获得别人无法捕获的信息，进而看到别人看不到的东西，破解别人发现不了的规律。

1983年，范伯格在肿瘤样本中发现了全基因组的DNA低甲基化现象，而GPS测序在30年后以更加精确的技术揭示了肿瘤细胞与正常细胞在全基因组DNA甲基化中的差异。学生开发的测序技术验证老师30年前的甲基化理论，这是学生对老师的致敬，也是后辈科研工作者站在巨人的肩膀上触摸星辰。科研总是严谨的，有逻辑的，但是这一切好像冥冥之中自有安排，缘分妙不可言。

时光倒回10年

千磨万击还坚劲，任尔东西南北风

2013年初，我们突发奇想，想要探索在肝癌细胞中发现的DNA甲基化位点是否可以在其他8种肿瘤细胞中得到验证。令人惊喜的是，我们发现了一个DNA甲基化位点竟然在8种肿瘤细胞中都呈现高度甲基化状态。这时，我作为一名临床医生的经验派上了用场，如果这个甲基化标志物在临床样本中检测结果为阴性，至少可以排除这8种肿瘤的可能性。迄今为止，这个甲基化位点已经在25种肿瘤中得到了验证。至于其他几种肿瘤，因非常罕见，我们无法找到样本，并且国际肿瘤数据库中也没有相关信息。因此，我们将这些肿瘤共有的甲基化位点命名为“全癌标志物（universal cancer only marker， UCOM）”，意味着它是存在于所有肿瘤中的标志物[5]。

在表观遗传学领域，只要存在共同的特征，就会有共同的表观遗传学规律。如果我们将肿瘤视为人体的一种另类器官，那么不同类型的肿瘤共享一些甲基化特征就不难理解。我们知道任何事物都有共性和个性，肿瘤也不例外，只是近年来精准医学的发展让我们对肿瘤的异质性有了更深刻的认识。但不能因为目前研究异质性的更多，就否认肿瘤共性的存在。我清楚地记得，2019年我们发表第一个全癌标志物时，《癌症研究》（Cancer Research）杂志的审稿人问了一个尖锐的问题：许多甲基化领域的专家都在寻找肿瘤共有的标志物，为什么其他人都没找到全癌标志物，而你们找到了呢？我只能回答说，因为我们拥有GPS技术，可以覆盖全基因组96%的CG位点，能够看到别人看不到的东西。

苹果砸在牛顿头上，牛顿发现了万有引力定律。然而，万有引力定律的存在与牛顿的发现无关，万有引力在牛顿发现之前就存在，在他发现之后仍然存在。全癌标志物也是如此，它的存在是客观的。实际上，验证全癌标志物只需要对肿瘤样本进行双盲测试。事实胜于雄辩，实践出真知。

时光倒回5年

路漫漫其修远兮，吾将上下而求索

作为一名拥有十几年临床经验的医生，我明白实验室检测和临床应用之间存在巨大的差别。为了全癌标志物能够在临床上应用，我们需要建立一种非常稳定的可重复的DNA甲基化检测方法。然而，正如之前所述，现有的使用重亚硫酸盐处理来检测DNA甲基化的方法存在诸多问题。因此，我们必须对该方法进行优化，尤其是去除重亚硫酸盐处理这一步骤。qPCR通常用于基因表达的定量检测，该方法简单、方便、成本低廉，是进行DNA甲基化检测的最佳选择。但是，在国际上还没有人尝试使用qPCR进行不经过重亚硫酸盐处理的甲基化定量检测。从2018年开始，我们用了4年的时间来优化甲基化检测方法，并将其称为Me-qPCR（methylation quantitative PCR）技术。该技术能够定量检测DNA甲基化，实现DNA甲基化检测的标准化、流程化和自动化。

目前，全癌标志物研究联盟已经完成了8万多例临床样本的甲基化双盲检测，验证了基于全癌标志物的Me-qPCR技术在DNA甲基化检测方面的巨大优势。在大量临床样本的检测和验证中，我们逐渐发现全癌标志物的一些特点。第一，全癌标志物具有“全”或“无”的特点，即正常组织中无全癌标志物甲基化异常，而在肿瘤组织中存在该标志物的高甲基化。切莫小看这个特点，正常组织不会出现全癌标志物甲基化异常，所以当患者样本中检测到全癌标志物异常，就认为该样本中存在恶性细胞。第二，全癌标志物是一个恶性肿瘤标志物。这一点非常重要，许多传统的肿瘤标志物并非专属于恶性肿瘤细胞，它们的检出率易受机体其他因素影响。第三，全癌标志物异常早于病理细胞形态学变化，这代表着全癌标志物能在“前癌”阶段检测肿瘤。尽管目前国际上还没有公认的肿瘤超早期标志物，但我认为全癌标志物具备这样的潜力，可以实现肿瘤的超早期诊断。如果将全癌标志物应用于肿瘤的早期检测，并制定有效的筛查方案，我们可以在肿瘤发展初期将其扼杀在萌芽阶段，最终实现让每个人远离癌症的目标。

时光倒回1年

莫愁前路无知己，天下谁人不识君

2022年，我们公布了第三个全癌标志物——SIX6基因[6]。从表观遗传学的角度出发，我们赋予全癌标志物更多的特点。例如，全癌标志物所在的基因通常在正常和肿瘤组织中都不表达。而且，这些基因大部分在文献中很少与肿瘤相关联，这表明全癌标志物在肿瘤发病机制方面与现有理论存在差异。我敢大胆推测，全癌标志物背后隐藏着一种全新的肿瘤发病机制，超越了我们目前肿瘤发病机制研究的范畴。

此外，全癌标志物的相关概念、特征和理念已经获得越来越多人的认可，并且我们已经与更多医院和医生展开了合作。第三个全癌标志物的发现让更多人认识到在妇科肿瘤以外的其他肿瘤中，全癌标志物也具有优异的检测效能。全癌標志物已经成功应用于宫颈癌、子宫内膜癌和尿路上皮癌等肿瘤的临床检测，并且我们已经与超过50家医院以及100多位知名临床专家展开了合作。相信不久的将来，全癌标志物会成为研究领域的热门话题。

时光倒回半年

独立千秋万古存，创造传世显英雄

2022年11月到12月期间，全癌标志物研究联盟参加了由科技部举办的全国颠覆性创新大赛，大赛共有2800个项目参与，涵盖了各个高新技术领域，包括半导体芯片、智能制造和生物医药等。该比赛要求创新项目必须具备改变游戏规则的特质。2022年11月23日，在苏州高新区进行的第一轮答辩中，全癌标志物以五票全通过的成绩顺利晋级复赛。2023年2月24日，在杭州举行的总决赛中，全癌标志物获得了最高奖项——优胜奖，在所有参赛项目中，获得优胜奖的概率不到2%，全癌标志物也是整个大赛中体外诊断（IVD）领域唯一的优胜奖。在颠覆性创新大赛的总结发言中，我说：“有人说，这世界上本没有路，走的人多了，就成了路。”事实上，走一条别人未曾走过的道路是相当艰辛的，我们需要克服各种困难，付出超出常人的努力。但不论别人相信与否，我们的目标是将解决问题置于首位。我们要与更多的人合作，将全癌标志物推广至全国乃至全世界，为大众和社会提供服务。

当前，卡脖子技术成了热议的话题，而我们现在解决“卡脖子”问题的方法是破解他人的卡脖子技术。然而，当我们破解他人的技术时，别人并没有停下脚步，反而研发出更多的卡脖子技术。那我们何时才能超越呢？我认为，最好的破解卡脖子技术的方法是我们也拥有“卡住别人脖子”的技术。只有做到技术反制，我们才能真正挺直腰杆，不再被他人卡脖子。

时光倒回3个月前

风正海阔千帆竞，百尺竿头再攀登

2023年4月28日，一个重要的时刻。基于全癌标志物的尿路上皮癌检测试剂盒获得了美国FDA突破性医疗器械认证。对于全癌标志物来说，这是获得国际认可的第一步。我们坚信，凭借全癌标志物独有的卓越性能以及我们自主研发的检测方案和方法，必将实现全癌标志物的广泛应用。真正的黄金总会闪耀光芒，而真金从不惧火炼。我们将以更新的技术和方案，实现肿瘤的早期诊断、疗效评估和预后判断的全流程监测。我们有信心，将肿瘤诊疗推向新的阶段，让我们的人民不再为癌症而心生恐惧！

陕西有一句俗语，叫做“猪没了，楼上找”，本意是形容一些不会做事的傻瓜。我们做研究的，应该勇于干一些“傻事”。换句话说，如果你按照别人的思路行事，你是无法解决颠覆性问题的。解决问题的关键是采用超常规思维、非常规技术，只有这样，我们才能真正超越自己。

展望未来

我们已经成立了全癌标志物研究联盟，希望更多的临床医生和基础研究者加入研究联盟，将全癌标志物应用于不同肿瘤的诊断、治疗和预后判断。此外，全癌标志物参与肿瘤发生的分子机制也是重要的科学问题，当我们弄清楚所有肿瘤的发病机制时，也许能够为肿瘤找到全新的治疗方法和策略。而在未来十年，我们的目标是让更多国家和人民因全癌标志物的应用而获益，并为他们的生活带来新的机遇。全癌标志物，大有可为，未来可期！

[1]Feinberg AP， Vogelstein B. Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts. Nature， 1983， 301： 89-92.

[2]Yu W， Ginjala V， Pant V， et al. Poly（ADP-ribosyl）ation regulates CTCF-dependent chromatin insulation. Nature Genetics， 2004， 36（10）： 1105-1110.

[3]Yu W， Gius D， Onyango P， et al. Epigenetic silencing of tumour suppressor gene P15 by its antisense RNA. Nature， 2008， 451： 202-206.

[4]Li J， Li Y， Li W， et al. Guide positioning sequencing identifies aberrant DNA methylation patterns that alter cell identity and tumor-immune surveillance networks. Genome Res， 2019， 29： 270-280.

[5]Dong S， Li W， Wang L， et al. Histone-related genes are hypermethylated in lung cancer and hypermethylated HIST1H4F could serve as a pan-cancer biomarker. Cancer Res， 2019， 79： 6101-6112.

[6]Dong S， Yang Z， Xu P， et al. Mutually exclusive epigenetic modification on SIX6 with hypermethylation for precancerous stage and metastasis emergence tracing. Signal Transduction and Targeted Therapy， 2022， 7： 208.

关键词：肿瘤 全癌标志物 DNA甲基化 导向定位测序 ■