基于网络药理学及实验研究探究坤泰胶囊异病同治卵巢早衰及绝经综合征作用机制

赵秀萍 马小娜 郭亚楠

(北京中医药大学第三附属医院妇科,北京,100029)

卵巢早衰(Premature Ovarian Failure,POF)是指女性40岁以前出现雌激素降低、促性腺激素水平升高并伴有月经紊乱、闭经甚至不孕的疾病,发病率为1%～3%[1]。其病因尚不明确,可能与免疫遗传、医源性损伤及环境、心理等因素有关。绝经综合征(Menopausal Syndrome,MS)又称绝经前后诸证或更年期综合征,是指MS妇女由于激素水平紊乱或降低引起的一系列以神经功能紊乱,伴有情绪异常等心理疾病的综合征,甚至出现机体器质性病变,严重影响生命质量,临床多见于45～60岁女性[2]。目前针对两疾病多以激素替代治疗缓解临床症状,但由于药物使用禁忌证较多,且害怕激素药物带来的不良反应,患者依从性和耐受性差。循证研究显示中医药可明显改善POF及MS患者多系统临床症状,提高生命质量,且不良反应少,依从性好[3]。

坤泰胶囊由黄连、白芍、阿胶、黄芩、熟地黄等中药组方而成,具有滋阴补血、交通心肾之功效。现代药理学研究证实,坤泰胶囊可有效调控MS患者性激素,升高患者血清白细胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)、5-羟色胺、β-内啡肽水平,提高机体免疫功能,疗效显著且安全性较高[4]。同时可以调节POF患者性激素代谢,降低促卵泡素,上调抗米勒管激素、IL-1β及血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)表达水平从而改善卵巢功能和临床症状[5]。坤泰胶囊异病同治POF和MS临床报道较多,但其药理学作用机制鲜有研究。网络药理学作为新兴交叉学科,可从生物学角度揭示药物活性成分、药理学作用机制,解析药物与疾病之间的分子关联,为新药研发和临床诊疗提供科研思路[6]。本研究基于中医异病同治法则,借助现代网络药理学研究坤泰胶囊治疗POF和MS的共同作用机制,期望为现代临床研究及科研提供新的方向。

1 资料与方法

1.1 基于网络药理学预测坤泰胶囊异病同治POF及MS作用机制

1.1.1 筛选坤泰胶囊活性成分及靶点 在中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)检索“熟地黄”“黄芩”“黄连”“白芍”“茯苓”药物成分,以口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%、类药性(Drug Likeness,DL)≥0.18及Caco-2渗透率≥0.4为标准筛选,在UniProt数据库中将靶点名称校正为Official Gene Symbol。Pubchem数据库获得成分Smiles结构,导入Swiss Target Prediction数据库(http：//www.swisstargetprediction.ch/)预测靶点。在中药分子机制生物信息学分析工具(Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechanism of Traditional Chinese Medicine，BATMAN-TCM)搜索“阿胶”，设置Score cutoff为30，P-value为0.05，得到其有效成分及作用靶点。

1.1.2 坤泰胶囊治疗POF和MS共有靶点 分别在GeneCards、人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)、Drugbank数据库以“Premature ovarian failure”“Menopausal Syndrome”为关键词检索POF和MS两疾病作用靶点,删除重复靶点进行标准化处理。将获得的成分靶点与两疾病靶点导入Venn 2.1.0软件得到交集靶点即坤泰胶囊治疗POF和MS的共同靶点。

1.1.3 构建“药物-疾病-共同靶点”网络 通过Cytoscape 3.7.2构建坤泰胶囊治疗POF和MS的“药物-疾病-共同靶点”网络图。利用Network Analyzer模块拓扑分析数据。

1.1.4 构建蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)网络 通过STRING数据库对坤泰胶囊治疗POF和MS的交集靶点进行PPI网络分析,导入Cytoscape软件,构建PPI网络并进行拓扑分析,根据自由度(Degree)、中介中心性(Betweenness)、接近中心性(Closeness)等相关参数筛选出核心靶点,根据筛选结果重新构建PPI核心靶点网络图。

1.1.5 基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析 将核心靶点上传至DAVID6.8数据库分别进行GO和KEGG富集分析,进一步探究坤泰胶囊治疗POF及MS交集靶点参与的生物过程(Biological Process,BP)、细胞组分(Cellular Component,CC)、分子功能(Molecular Function,MF)及信号通路。保留GO、KEGG富集分析结果,设置P<0.01,根据P-value及靶点数目选取前20个条目,以气泡图进行可视化展示。

1.2 实验验证

1.2.1 动物 选取12周龄健康雌性SD大鼠,体质量为(200±20)g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司[合格证编号SCXK(京)2016-0006]。所有大鼠均饲养在动物房内,保持室内温度恒定25 ℃,光照12 h日夜交替循环。所有大鼠均自由进食摄水,适应新环境7 d后进行后续实验。之后每日定时做阴道涂片检查,观察大鼠动情周期,一般为4～5 d,实验选择动情周期正常的大鼠进行。经北京中医药大学动物伦理委员会批准(伦理审批号:BUCM-4-2021042003-2131)。

1.2.2 药物、试剂与仪器 坤泰胶囊(贵阳新天药业股份有限公司,批号:210927);注射用环磷酰胺(江苏恒瑞医药有限公司,批号:170508);补佳乐(戊酸雌二醇,拜耳医药保健有限公司,批号:J20171038);注射用青霉素钠(华北制药有限公司,批号:210502)。卵泡生成素(Follicle Stimulating Hormone,FSH)、黄体生成素(Luteinizing Hormone,LH)、雌二醇(Estradiol,E2)采用酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)方法检测,均购于武汉Elabscience公司;白细胞介素-6(IL-6)ELISA试剂盒(货号:SP13755)、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)ELISA试剂盒(货号:SP12250)均购自武汉赛培生物科技有限公司;小动物麻醉机(玉研仪器厂)、高速离心机(Sigma公司,德国,型号:1-13)。

1.2.3 造模、分组与给药 POF:随机数字法将大鼠分空白组、模型组、补佳乐组、坤泰胶囊组,每组8只。空白组腹腔注射0.9%生理盐水1次仿造模,并每天蒸馏水灌胃1次。模型组采用环磷酰胺单剂量120 mg/kg腹腔内注射建立POF模型[7],用药1周后观察阴道脱落细胞涂片,出现大鼠动情周期紊乱,渐至无动情周期为造模成功,每天蒸馏水灌胃1次。坤泰胶囊组模型组大鼠给予坤泰胶囊0.5 g/(kg·d)灌胃,1次/d。补佳乐组模型组大鼠给予戊酸雌二醇0.2 mg/(kg·d)灌胃,1次/d。

MS:随机分为假手术组、模型组、补佳乐组、坤泰胶囊组,每组8只。参照文献[8]制备MS大鼠模型,假手术组切除卵巢旁等体积脂肪组织,不摘卵巢,其余3组结扎血管后完整切除双侧卵巢。手术后所有大鼠均肌内注射青霉素钠,连续3 d,1次/d,以预防术后感染。术后第5天对动物逐只进行阴道涂片,连续3 d不出现动情周期表示造模成功。假手术组及模型组给予蒸馏水灌胃,1次/d,补佳乐组及坤泰胶囊组给药同前。

1.2.4 标本采集及实验 给药12周后各组大鼠禁食12 h进行取材。将大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉用量,取5 mL腹主动脉血,以3 000 r/min离心(有效离心半径10 cm)10 min,取上层血清置于-80 ℃冰箱中保存备用。分离血清进行ELISA实验,均按试剂盒要求步骤操作。

2 结果

2.1 筛选坤泰胶囊活性成分与潜在靶点 检索获得化合物51个,其中熟地黄2个,黄芩29个,黄连9个,阿胶、白芍各3个,茯苓5个。按度值排序靠前的化合物有黄芩黄酮(Rivularin)、表小檗碱(Epiberberine)、L-赖氨酸(Lysine)、谷甾醇(Sitosterol)等。将化合物进行靶点预测,获得阿胶靶点164个,白芍73个,茯苓132个,黄连306个,熟地黄47个,黄芩417个,删除重复靶点最终得到坤泰胶囊成分靶点714个。见表1。

表1 坤泰胶囊主要活性成分(Degree前10位)

2.2 构建“药物-疾病-共同靶点”网络 经筛选最终获得POF靶点1 423个,MS靶点1 017个,将两疾病靶点与坤泰胶囊药物靶点取交集,得到POF与坤泰胶囊交集靶点210个,MS与坤泰胶囊交集靶点168个,而3者共同靶点128个。见图1。“药物-疾病-共同靶点”网络中有135个节点,包含药物节点5个,疾病节点2个,靶标节点128个及394条边,其中与黄连相关靶点最多为57个,涉及靶点有ESR1、SHBG、ESR2、CYP19A1等。见图2。

图1 坤泰胶囊治疗POF和MS的共同靶点韦恩图

图2 坤泰胶囊治疗POF和MS“药物-共同靶点-疾病”网络

2.3 构建核心靶点PPI网络 获得51个核心靶点,PPI网络由51个节点、856条边组成,平均度值为31.6。同样方法经过2次筛选获得核心靶点包含GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、SRC(原癌基因酪氨酸受体激酶)、IL-6(白细胞介素-6)、TNF(肿瘤坏死因子)、ESR1(雌激素受体1)、AKT1(蛋白激酶B1)、EGFR(表皮生长因子受体)、CASP3(胱天蛋白酶3)等。推测其可能是坤泰胶囊异病同治POF和绝经综合征过程中的关键靶点。见图3。

图3 坤泰胶囊治疗POF和MS的核心靶点PPI网络

2.4 核心靶点GO功能及KEGG信号通路分析 该研究GO富集分析获得322个生物过程、39个细胞组分、74个分子功能。KEGG富集涉及105条信号通路,设置P-Value<0.01,取前20个条目分别绘制高级气泡图。见图4。结果显示,坤泰胶囊异病同治POF和MS的生物学过程主要有:一氧化氮生物合成过程的正调控、蛋白质自磷酸化、磷脂酰肌醇介导的信号转导等;细胞组分主要涉及质膜、细胞核、细胞膜穴样内陷等;分子功能主要有蛋白酪氨酸激酶活性、酶结合、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白质结合等;KEGG富集主要信号通路有癌症通路、胰腺癌信号通路、缺氧诱导因子-1(Hypoxia-inducible Factor-1,HIF-1)信号通路、磷脂酰肌醇-3-激酶和蛋白激酶B(Phosphatidylinositol 3-kinase and Protein Kinase B,PI3K-AKT)信号通路,推测以上生物学过程及信号通路可在坤泰胶囊异病同治POF及MS过程中发挥作用。

图4 坤泰胶囊异病同治POF和MS靶点GO和KEGG分析注:图A、B、C为核心靶点GO分析;图D为核心靶点KEGG富集分析

2.5 各组大鼠血清FSH、LH、E2比较 POF及MS中模型组大鼠与空白组、假手术组比较,E2均明显降低,而FSH、LH明显升高,差异均有统计学意义(均P<0.05);干预后,POF及MS大鼠补佳乐组、坤泰组较模型组中E2均升高,而FSH、LH有所降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。POF:坤泰组大鼠血清E2较补佳乐组升高更显著,差异有统计学意义(P<0.05)。MS坤泰组:大鼠血清E2、FSH、LH变化较补佳乐组,差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠FSH、LH、E2测定

2.6 各组大鼠血清IL-6、TNF-α水平比较 IL-6、TNF-α是坤泰胶囊异病同治POF和MS共有靶点。与空白组(假手术组)比较,POF及MS模型组大鼠血清IL-6、TNF-α水平明显上升(均P<0.05);而药物干预后,POF及MS中坤泰胶囊组大鼠血清中IL-6、TNF-α水平均较模型组均下降(P<0.05)。见图5。

图5 POF与MS大鼠血清IL-6、TNF-α水平比较注:与空白组(假手术组)比较,*P<0.05;与模型组比较,△P<0.05

3 讨论

异病同治作为中医特色治病法则,不着眼于疾病的异同,而是重视疾病的病机及辨证,即可以针对辨证、病机相同或相似的不同疾病采取相同的治疗方法或用药。从异病同治理论,借助网络药理学分析坤泰胶囊治疗POF和MS作用机制,是中医药守正创新的体现,也是基于生物网络技术对不同疾病共有靶点及信号通路等分子机制的探索。POF与MS病因病机及临床表现有相似之处。POF是指胞宫功能未老先衰,先天肾气亏虚或后天因素导致肾虚精亏、天癸不足为其根本,肝郁气滞、脾虚失运、瘀血阻滞是其常见病机[9],诸多因素导致肾-天癸-冲任-胞宫轴功能失调,从而出现经水早绝甚至不孕。而MS病机是以肾虚为本,肾的阴阳平衡失调影响到心、肝、脾,从而出现一系列病理变化,POF及MS病位都在冲任、胞宫,与肝、肾密切相关。坤泰胶囊主要功效为养血滋阴,益髓补精、调节阴阳平衡,故可用于治疗POF和MS的共同研究。

本研究获得坤泰胶囊活性成分主要有黄芩黄酮、表小檗碱、L-赖氨酸、谷甾醇及氧化小檗碱等。其中表小檗碱、氧化小檗碱均属于生物碱类化合物,为黄芩和黄连的共有成分,研究显示,该类化合物可通过AKT、ERK通路、p53/Bax凋亡通路发挥抗肿瘤、抗炎、抗氧化的作用[10]。而谷甾醇则具有雌激素样活性,可促进卵巢颗粒细胞产生雌激素,并与骨细胞膜雌激素受体结合加强成骨,对POF或绝经后骨代谢失衡具有调节作用[11]。研究获取坤泰胶囊治疗POF和MS共有靶点128个。拓扑分析筛选出核心靶点GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、SRC(原癌基因酪氨酸受体激酶)、IL-6(白细胞介素-6)、TNF(肿瘤坏死因子)、ESR1(雌激素受体1)、AKT1(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)等,分别与肿瘤的发生、细胞增殖与分化、存活和侵袭细胞增殖与凋亡、免疫调节、血管生成等机制有关。其中,GAPDH是糖酵解的关键酶,对氧化修饰敏感,并通过细胞核中的Sirt1(沉默信息调节因子1)/p53通路参与凋亡信号,上调GAPDH表达来减轻氧化应激诱导的周期细胞凋亡[12]。目前已有研究发现AKT1、TNF、IL-6、EGFR等靶点参与卵巢生殖细胞的生长、发育与卵泡凋亡等过程,当其异常表达时可促进细胞异常增殖,导致卵泡成熟障碍及卵泡凋亡[13],卵泡池过早耗竭出现POF或造成更年期综合征的发生[14-15]。TNF-α基因308G/A位点多态性与TNF-α表达水平有关,且不同基因型POF患者TNF-α水平之间存在很大差异,可能是导致POF的主要遗传易感基因[16]。研究证实,当机体雌激素水平下降时,Th17细胞被过度激活,而IL-6、TNF等炎症介质可诱导CD4+T细胞分化为Th17,从而诱发免疫性POF发生[17-18]。本研究采用实验研究表明坤泰胶囊能够改善POF及MS模型大鼠性激素水平,同时可有效降低模型大鼠血清IL-6及TNF-α水平。

KEGG富集分析结果显示坤泰胶囊异病同治POF和MS主要涉及癌症相关通路、胰腺癌信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-AKT信号通路、TNF信号通路等。研究显示,PI3K-AKT信号通路可参与POF及绝经等卵巢相关疾病的发生,其通路中的相关因子可参与调节卵母细胞生长、原始卵泡发育以及颗粒细胞的增殖、分化和迁移,如PI3K-AKT过度激活可使原始卵泡提前发育、卵泡过快凋亡,从而出现卵泡闭锁、功能衰退[19-20]。HIF-1α信号通路是缺氧相关性自噬的重要通路,HIF-1α可通过调节下游血管内皮生长因子,调节卵泡中血管发育参与卵泡发育、衰老过程,其水平高低与卵泡发育水平负相关[21]。缺氧条件可产生活性氧,引起氧化应激,激活卵巢细胞自噬从而维持细胞存活与增殖,长时间可诱导颗粒细胞和卵母细胞自噬、凋亡和坏死导致卵母细胞质量及数量下降、卵泡闭锁[22]。该通路还参与了小鼠绝经后骨质疏松的病理过程,抑制HIF-1α信号通路可改善绝经后骨质疏松的严重程度,推测绝经后骨组织破骨细胞中HIF-1α上调与蛋白激酶B、胞外信号调节激酶和核因子κB信号通路中某条或几条联合作用有关[23]。而TNF信号通路是核心炎症信号通路,已知颗粒细胞既是TNF-α的来源器官,也是TNF-α的靶器官,可显著降低颗粒细胞在促卵泡素刺激下的分化以及卵泡成熟期间对黄体生成素的反应,在颗粒细胞凋亡和分化过程中发挥着重要作用[24]。雌激素可调控卵泡细胞生长、发育和分化等多种生理过程,雌激素信号通路是雌激素与细胞核中的雌激素受体结合,作用于雌激素受体反应元件调节基因表达,从而改变细胞功能,对女性卵巢及生殖功能至关重要,同时可激活PI3K信号通路发挥相关生理作用[25]。既往从临床观察及实验研究都证实了坤泰胶囊治疗POF和MS效果明确,且在一定程度上验证了本研究中所筛选出的一些靶点和通路。

综上所述,坤泰胶囊治疗POF和MS是涉及多成分、多靶点、多通路的复杂过程,其主要成分包含表小檗碱、谷甾醇、氧化小檗碱,涉及GAPDH、SRC、IL-6、TNF等核心靶点,参与调控PI3K-AKT、TNF及HIF-1α等信号通路。但坤泰胶囊异病同治作用机制是否涉及癌症相关通路、胰腺癌及癌症的中枢碳代谢等信号通路仍需要进一步研究和实验验证。

利益冲突声明:无。