食品微生物检验菌种标准化管理分析

刘 玲

（张家川回族自治县食品药品检验检测中心，甘肃天水 741500）

近年来，我国食品中毒事件频频发生，食品安全备受关注，微生物污染是食品中毒的原因之一。为了能够减少食源性疾病的发生，我国进一步加强了食品安全管理，并在实际工作中采用食品微生物检验方法进行食品安全监测。《检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明》（CNASCL01-A025:2022）明确规定，实验室必须存有满足试验要求的标准菌种，且需从人、机、料、法、环等方面进行菌种的质量管理，以保证微生物检验工作的质量和检验结果的准确性。由此可见，有必要对食品微生物检验菌种进行标准化管理[1-2]。

1 标准菌种的特性

CNAS-CL01-A025:2022明确规定，实验室试验用的菌种必须从认可的菌种或标本收集途径获得，以保证菌种来源的可靠性。因此，溯源性是标准菌种的特性。为保证其特性，菌种的获得须从国际认可或国家设立的菌种保藏机构中购买或索取，不得使用无资质机构提供的无证菌种，且持证的菌种不可随意赠送、转让，必须按规定进行。

2 标准菌种的标准化管理

2.1 标准菌株的选择及采购

标准菌株应从专业微生物菌株保藏机构或有合格资质的供应商中购买获得，如美国菌株保藏中心、中国医学微生物菌种保藏中心、工业微生物菌种保藏管理中心等。标准菌株的采购应参照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》（GB 4789.2—2022）的规定选择，优先选择形态、染色、生理生化等特性稳定且实验结果重复性好、不会发生变异的菌种。在确定菌株后，还需核对菌种编号等信息。

2.2 标准菌株的验收、复苏、确认、传代、使用及销毁

2.2.1 验收

在标准菌株入库环节，应着重检查其包装完整与否、是否临近保质期等，还需对其是否满足冷冻运送的条件进行确认，若满足条件，则进行入库备案，并记录接收菌种的时间、菌种名称、菌种产地、菌种编号以及接收实验室名称等信息，执行双档案制，即纸质档案和电子档案同时记录[3]。

2.2.2 复苏

菌种复苏是菌种保藏的首要环节。在菌种复苏时，须严格按照菌种说明书要求进行，确保菌种及时恢复其旺盛的生命活力。

2.2.3 确认

待菌种复苏后，需对储备菌株进行必要的纯化试验及生化鉴定试验。标准储备菌株指标准菌株经过复活且能在适宜的培养基中生长的菌株，已经解冻的标准菌种不可继续使用，也不能继续冻结，应及时记录，以保证菌种使用及保藏的溯源性。此外，工作菌株不可作为标准菌种进行试验，工作菌株指使用标准菌株法的商业派生菌株[4]。在对标准储备菌株进行纯化试验及生化鉴定试验的过程中，需及时记录菌种的名称、变化、验证依据、鉴定人员和试验结果等信息，只有鉴定结果符合条件要求的菌种，才可进行保存和传代。

2.2.4 传代

对于菌株的传代，除非标准方法中有特殊的规定与要求，具有能证明菌株特征未发生变化的文件依据，否则菌株的传代次数不可超过5次，避免过度传代使菌种发生变异。还应定期对菌株进行传代，并对菌种试验所需的存活度、纯度等关键指标进行确认。

2.2.5 使用和销毁

标准菌种做参照标本时，需领取标准菌种，并填写领用登记表，填写内容包括菌种名称、编号、使用日期、用途、使用人员和管理人员签字，经过菌种管理人员批准方可领取使用。针对有突变、污染、衰退的菌种，经过鉴定确认不合格或没有使用需求，应及时销毁菌种，并记录销毁菌种的名称、编码、销毁日期和销毁方法等信息。为避免造成检测环境及设施设备的污染，有必要建立完善的菌种销毁管理制度。只有符合国家环保标准及卫生安全规范的菌种，才可作为污染废弃物弃置。

2.3 菌株的保藏

2.3.1 原则

①不同菌种的生物学特征有所差异，需要针对性选择适宜的保藏方法。②要尽可能地避免杂菌对菌种保藏过程的影响，最大限度地保护菌种不会衰退和消亡。③注意菌种的安全保存，避免其对周围环境及设施设备造成污染和破坏。④严格按照国家生物安全要求进行菌种保藏管理，并在划分微生物菌种危险级别及安全等级的基础上，严格按照对应的实验室条件进行操作，做好个人安全防护和环境保护工作。

2.3.2 方法

（1）多孔磁珠低温保藏法。对于有长期保护要求的细菌、真菌、放线菌等，可选用多孔磁珠低温保藏法进行保藏。该方法以低温的环境短暂停止菌种的新陈代谢，以此实现菌种的保藏。因此，冷冻温度越低，保藏效果越好。在使用该方法进行菌种保藏时，需注意几点要求。①注意对冷冻存管进行无菌操作，保证菌种能长时间保存。②须在生物安全箱中完成菌种的储存和复苏等作业。③使用过的冷冻存管必须进行处理，避免环境遭受污染。④在冷藏保藏过程中，要注意控制冷藏及解冻的速度，通常有效的冻结速度在1 ℃·min-1以内，有效的解冻速度为1 min从-70 ℃解冻至-20 ℃。⑤低温槽具有一定的空间，若发现温度有变，可适当在低温槽中加入干冰，保证冷冻效果。⑥倘若菌种解冻后无法继续使用，则需中心接种后再使用和保存。多孔磁珠低温保藏法具体应用流程如下。①菌种保护管的选择。可选择商品化保护管，且避免保护管有裂缝。②培养物准备。优先选择具有较高生物活力的培养物。不同菌种的生理生化特征不同，存活率也有所不同。在准备培养物时，可以刮取斜面上的菌种，并放入磁珠冷冻管中保存。有严格保存要求的厌氧菌，通常一个冷冻管中要刮取4～5个斜面板上的细菌。在准备培养物时，还可以接种液态培养基，将管内除磁珠外的全部物质吸干，通过振荡产生菌悬液，以液态的形式存在于培养基中。③使用磁珠冻存管。标记冻存管，记录菌种名称、编号、实验室名称和转移时间。菌种培育需在适宜的环境下进行，直到菌种稳定或是到达成熟期，须进行纯度等生化测试，确认培育的菌株符合要求后才可进入冻存管中保藏。④保藏周期。在-30～-70 ℃进行冻存管的储存，-30 ℃的储存时间是1～5年，-70 ℃可适当延长保藏的时间或者常年保藏。如果定期检验确认菌种不能满足其生物学功能，则需要及时销毁或补充储存。⑤培养恢复。待对工作环境无菌化处理后，打开冻存管，用无菌针取出1粒磁珠，及时封管并送至适宜温度环境下进行储存，冻存管运送期间应使用专门的保温运输设备[5]。

（2）定期移植保藏法。定期移植保藏法适用于有长时间保藏要求的菌种，不同菌株需结合实际选择适宜的培养基进行培育。该方法通过适宜的环境温度减慢菌株的新陈代谢过程，使其生产速率减慢，既能减少突变，又能延长菌株的保藏期。在应用定期移植保藏法时，可选择不同的细菌注射方法，如斜面注射、液体接种、穿刺注射等。在使用该方法进行菌种保藏时，应明确几点要求。①在恰当的培养基中接种，避免人为及环境的污染。②在保藏期间，需定期进行室温与湿度的检查，尤其要检查菌种储藏的房间及冷库，避免培养基干燥，若发现室温和湿度有异常，需要考虑移栽培育。③在菌株传代时，为保留菌株的优良特征，应在养分充足的培养基中栽培。④每一次的移植培养都需要逐一检验比较保藏菌种及其分解卡片，确认无误后存放。⑤针对不能频繁移植保藏的菌株，可加大每次移植的数量，以延长使用期。⑥菌株数量越多，意味着移植的隔离期限有较大的差异。一般不形成芽胞的细菌的持续时间是1～2周，最长1个月左右。但某些菌株一般需要2个月左右才能完成移植。酵母、放线菌等连续生长的菌种的间隔时间较长，一般在5个月以内完成移植。

（3）斜面低温保藏法。斜面低温保藏法通常用于工作用菌种的保藏。具体操作流程为在固体斜面培养基中完成菌种的接种工作，待菌种生长稳定或成熟后，再将其移至2～8 ℃冰箱中进行保藏。斜面低温保藏方法具有操作简单、设备要求简单、菌种存活率高等优势，适应大部分菌种的短期保藏，但不适宜菌种的长期保藏，主要因为在2～8 ℃的环境保藏，菌种具有一定的代谢能力，会降低菌种活性，需要反复多次的传代培养，可能会发生变异或污染。

（4）脱脂牛奶保藏法。脱脂牛奶保藏法适用于菌种的中长期保藏。其应用的主要流程是先将新鲜纯培养物接种至灭菌处理的脱脂牛奶中，充分混匀后形成浓菌液，分装在无菌保藏管中保藏。一般在-20 ℃的环境下，保藏时间3年以上。脱脂牛奶保藏法的优势是操作简单、设备要求低、不需要特殊设备且不需要反复传代，有良好的保存效果。

（5）液体石蜡保藏法。液体石蜡保藏法在改良斜面低温保藏法的基础上进行菌种的保藏，用液体石蜡覆盖固体斜面或穿刺培养的半固体高层培养基，以此营造无氧环境，使菌种在无氧的环境下生长，可避免培养基水分蒸发，进而延长菌种保藏的时间。在应用该方法时，需要对液体石蜡进行灭菌处理，之后再滴至培养基表面，应保证石蜡厚度高出菌种表面约1 cm，使菌体与空气隔离。在4 ℃的环境下，保持试管直立，进行保藏，保藏时间1～2年，甚至更长。该保藏方法的优势是能够有效弥补斜面低温保藏法的不足，延长菌种保持的时间，因此适用中长期保藏。这一方法也适用于无法分解液体石蜡的大部分菌种，但并不意味液体石蜡保藏法没有缺陷，该法需要保持试管始终处于直立的状态，所需空间大，携带不便。

（6）甘油冷冻管保藏法。甘油冷冻管保藏法适用于菌种的中长期保藏。在生长良好的培养板上刮取新鲜纯培养物，接种至适宜的培养基中，待培养菌的密度OD600为1.0～1.5时，在菌悬浮液中加入相同体积浓度为20%的无菌甘油，轻轻振荡混匀，分装至无菌小试管中。试管冷冻储存温度为-20～-80 ℃。在-20 ℃冷冻条件下，可保藏1～2年；在-80 ℃的冷冻条件下，可保藏2～4年，温度越低，保藏的时间越长。这一保藏方法的优势是适用范围广，有良好的保藏效果，尤其是链球菌、弧菌等苛性菌，保藏时间长，菌种变异的可能性低。

2.4 人员管理要求

菌种管理要有专人负责，包括菌种的申购、验收、复苏、确认、传代和保藏等各个环节。菌种管理人员要有强烈的岗位责任意识，严格按照微生物检验操作流程及要求进行菌种管理工作，要具有扎实的菌种基础知识及工作经验，熟练掌握各种菌种复苏、传代、保藏的条件。对于菌种的采购，菌种管理人员必须要从有资质的机构中购买，并在验收环节针对每一种菌种的质量及检验报告进行检查，检查过程除了外观检查，还有纯度与特性的确认。

2.5 环境管理要求及生物安全

为保证菌种能长期有效的保存，加强环境管理非常重要。应保证微生物在低温环境下存放，低温环境可降低其生长速度。通常实验所用的工作菌种宜在2～8 ℃的环境中保藏，标准储备菌株需要在-20～-80 ℃的低温环境中保藏。

在实际的菌种管理过程中，严格执行《病原微生物生物安全通用要求》《微生物菌种常规保藏技术规程》《人间传染的病原微生物名录》等规范的要求，保证实验过程为无菌化操作过程，要重视个人防护及环境保护，避免发生污染。

2.6 设备管理要求

在菌株保藏管理过程中，要保证实验室具有相应的设备，包括低温或超低温冰箱、冷冻干燥机等。实施“双人双锁”管理机制管理菌种，加强设备监控，定期检查和维护设备，及时发现异常，及时维修。

3 结论

本文对食品微生物检验菌种的标准化管理进行了分析探讨，得出以下结论。①菌种管理必须要结合实际情况进行，要制定完善的管理机制并严格执行。②应从人、机、料、法、环等维度开展菌种管理工作，并保证实验操作的规范性，避免发生污染，保证菌种的可靠性和溯源性。③菌种的保藏需合理选择保藏方法，要充分考虑菌种自身的特性、保藏目的以及实验室的设备条件。一般至少要选择两种保藏方法，且需对复苏菌种的关键性指标定期检验，确保菌种的活性与特性。