一株耐单宁酵母菌的筛选、鉴定及发酵特性

谭川川,何劲*,魏雨萌,辛文燕,姚蜜,岑顺友

1(贵阳学院 食品与制药工程学院,贵州 贵阳,550005)2(贵州省果品加工工程技术研究中心,贵州 贵阳,550005)3(贵州宏财聚农投资有限责任公司,贵州 六盘水,553537)

单宁,又称鞣酸,多酚类化合物,源于植物的次级代谢产物,多分布于叶、种子、果肉、表皮等,主要形式为黄烷-3-醇与儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯等以C4～C6或C4～C8键构成的聚合物[1],具有抗氧化、降血糖、抗肿瘤、修复口腔黏膜、提高免疫力等功效[2-3],已被广泛用于食品、医药等方面。单宁广泛存在于刺梨、石榴等多种水果中,具有保护花色苷、提高色素附着,抑制微生物侵染等作用[4-5]。单宁较高的水果,一般富含维生素类、多糖类、皂苷类等多种活性物质,是良好的酿造原料[6]。单宁在果酒中作为非挥发性成分,有助于感知口感、平衡酒体、沉淀蛋白、影响发酵过程香气物质的转化及释放[7-8]。过高的单宁含量会使酵母细胞壁蛋白的黏附性降低,导致发酵迟缓或菌体死亡,减弱发酵能力[9]。此外,部分微生物会分泌单宁酶,以降低单宁对自身的损害。目前,商业酵母在高单宁水果发酵中存在发酵不彻底、酯香不足、口味不佳等问题。国内外企业一般采用降低单宁以适应发酵,使得果酒品质不稳定。因此,从高单宁水果筛选耐受性好的野生酵母,延长酵母在酿造中的作用时间,对更好地开发高单宁水果资源具有实际意义。

本研究以单宁胁迫策略从高单宁水果(刺梨、石榴、青李)中特异性分离、筛选得到贝氏酵母1株,对其最适生长温度、最适生长pH及耐单宁、耐乙醇、耐葡萄糖、耐SO2性能进行检测,并对其发酵性能及风味组成进行评估,旨在获得适合高单宁水果发酵的酵母菌株,为丰富酵母资源及提升果酒酿造品质提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

刺梨、石榴、青李,贵州、四川等地区;酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)SY,安琪酵母股份有限公司;2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC)、单宁酸,Solarbio公司;WL营养琼脂,杭州百思生物科技有限公司;纤维二糖、棉子糖、松三糖,杭州滨和微生物试剂有限公司;2-酮基-D-葡萄糖酸半钙、甲基-α-D-葡萄糖苷,上海源叶生物科技有限公司;焦亚硫酸钾,上海麦克林生化科技有限公司。

YPD培养基(g/L):葡萄糖20、蛋白胨20、酵母浸膏10、琼脂20,液体不加琼脂;TTC培养基(g/L):葡萄糖5、琼脂15、TTC 0.5;果酒发酵培养基(g/L):刺梨渣60、拐枣渣20、水150、焦亚硫酸钾0.08,调整至糖度为20 °Brix,pH为4.6。以上培养基配制完成后,均于105 ℃灭菌10 min。

MHP-160霉菌培养箱,上海精其仪器有限公司;DH5000B高压蒸汽灭菌锅,上海申安医疗器械厂;SHZ-S2气浴恒温振荡器,常州金坛良友仪器有限公司;PEN3型电子鼻,德国AIRSENSE公司;PYL-3糖度计,日本ATAGO公司;PHS-3C型pH计,上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酵母菌的分离纯化

挑取刺梨、脆青李、石榴腐烂部位划线到YPD培养基中,28 ℃培养,挑选形态类似酵母的菌落,多次纯化得到单一菌落,编号斜面保藏。

1.2.2 耐单宁酵母的筛选

将上述保藏菌株,以4 g/L单宁的YPD培养基,结合WL(wallerstein laboratory)培养基显色法、TTC显色法、杜氏小管产气法、嗅闻法、显微镜法筛选优良性能的菌株。

1.2.3 耐单宁酵母N1的鉴定

形态学观察:将N1菌株划线于含有4 g/L单宁的YPD培养基上培养48 h,观察酵母菌落特征;并挑取酵母菌体制片,在100倍油镜下观察酵母微观形态。

生理生化鉴定:参考TheYeasts,aTaxonomicStudy手册,进行糖发酵、碳源同化、氮源同化、37 ℃生长、无维生素生长、酸性环境生长、重氮基蓝B等试验。

分子生物学鉴定:采用通用引物ITS1/ITS4扩增ITS并测序,序列经GenBank数据库比对,采用MAGE-7软件以邻接(neighbor-joining, NJ)法构建系统发育树。

1.2.4 耐单宁酵母N1的生长及耐受特性

1.2.4.1 生长特性

种子液制备:挑取斜面菌株接入YPD液体培养基中,28 ℃,150 r/min摇床培养,使OD600在0.5～0.6之间。

最适生长温度、最适pH的确定:分别设置温度为16、20、24、28、32、36、40 ℃;pH为3、4、5、6、7、8,接种量2%(体积分数,下同),150 r/min培养24 h,测定其OD600值。

生长曲线测定:按最适生长温度、最适pH重新制备种子液,接种量2%,150 r/min摇床培养。每4 h取样,测定其OD600值。以未接种培养基为空白对照,绘制生长曲线。

1.2.4.2 耐受性

耐单宁试验:参考KANPIENGJAI等[10]的方法,分别配制单宁浓度为0、2、4、8、16、32 g/L的YPD培养基,以牙签穿刺接种,28 ℃培养48 h,记录生长状况及菌落直径。

耐葡萄糖试验:以2%接种量分别接种于200、250、300、350、400 g/L不同葡萄糖质量浓度的YPD液体培养基,28 ℃培养24 h,测定其OD600值。

耐乙醇试验:以2%接种量分别接种于4%、8%、12%、16%、20%、24%不同乙醇体积的YPD液体培养基,28 ℃培养24 h,测定其OD600值。

耐SO2试验:以K2S2O5调节SO2浓度,以2%接种量分别接种于50、100、150、200、250 mg/L不同SO2质量浓度的YPD液体培养基,28 ℃培养24 h,测定其OD600值。

1.2.5 耐单宁酵母N1的单宁降解转化试验

参考丁栋等[11]的方法,以单宁浓度为横坐标,OD530值为纵坐标,构建单宁标准曲线。取10 g刺梨干粉加50 g水,高温高压灭菌备用。以2 mL接种量接种,2 mL无菌水为空白对照,28 ℃发酵处理5 d,测定单宁含量。单宁降解率的计算如公式(1)所示:

(1)

1.2.6 耐单宁酵母N1的果酒发酵试验

1.2.6.1 发酵力

按8%的接种量于刺梨果酒发酵培养基,22 ℃发酵。每24 h测定质量损失以监测发酵,发酵15 d。

1.2.6.2 发酵指标测定

发酵结束后测定发酵液中酒精度、总酯、残糖、总酸、干浸出物含量。参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[12]及GB/T 10345—2022《白酒分析方法》[13]测定。

1.2.7 耐单宁酵母N1的发酵果酒风味成分分析

采用PEN3型电子鼻进行果酒风味成分测定。方法参照CAO等[14]修改,样品重复测定5次;将WinMuster数据用SPSS软件、Origin 2021进行雷达图响应值分析、传感器贡献率分析(loadings analysis)、主成分分析(principal component analysis, PCA)。

2 结果与分析

2.1 酵母菌形态及培养特征

经分离纯化,初步得到45株耐单宁酵母菌株,11株来自刺梨,11株来自脆青李,23株来自石榴。经筛选,获得1株性能良好的耐单宁酵母菌N1,见图1。酵母在4 g/L单宁的YPD培养基上呈乳白色,圆形凸起,表面湿润,黏稠,有光泽,有强烈的果香味,酒精味;显微镜下呈圆形,出芽生殖。

a-在YPD培养基上菌落形态;b-显微镜下细胞形态

2.2 耐单宁酵母N1的鉴定

由图2可知,菌株N1,与贝氏酵母(Saccharomycesbayanus×Saccharomycescerevisiae)(LT577618.1)聚于一个分支,具有100%的相似度;生理生化特征也一致,见表1。最终鉴定菌株N1为贝氏酵母(Saccharomycesbayanus)。

表1 菌株N1生理生化鉴定试验结果

图2 基于ITS序列菌株N1系统发育树

2.3 生长及耐受性试验

2.3.1 最适生长温度、最适pH及生长曲线

N1最适生长温度、最适pH及生长曲线见图3。温度能影响酵母对营养物质的代谢转化速率,影响发酵的整体风味[15]。N1受温度影响较大,吸光值呈先增加后下降的显著趋势(P<0.05),28 ℃有最大吸光值,为最适生长温度;pH能影响酵母原生质膜电荷转移,改变离子渗透性,进而影响生长[16]。N1在pH 3～8时吸光值呈先增加后下降的显著趋势(P<0.05),在pH 6时有最大吸光值,且酸性条件生长良好,能够适应低pH环境;由生长曲线可知,N1在0～8 h处于延迟期,生长缓慢;8 h后进入对数期,繁殖旺盛,24 h时增速减缓;36 h后进入稳定期,菌体密度稳定;72 h后进入衰亡期。

a-最适温度;b-最适pH;c-生长曲线

2.3.2 耐受性试验

糖类是酵母增殖发酵所必需营养物质[17]。如图4-a所示,随着葡萄糖的增加,N1的吸光值呈先增加后减小趋势(P<0.05)。N1在质量浓度为400 g/L时仍有较好的耐受,满足果酒发酵要求。

a-葡萄糖耐受性;b-乙醇耐受性;c-SO2耐受性;d-单宁耐受性

醇类会影响酵母相关膜及代谢通路的稳定性,阻碍酵母生长和糖利用能力[18-19]。随着乙醇浓度的增加,N1的吸光值逐渐降低,在16%后受到明显抑制(图4-b),符合低度果酒发酵。

SO2在果酒中可以提高澄清率、防止酸败,但SO2残留会影响果酒品质。如图4-c所示,SO2浓度与N1生长呈负相关性;N1在250 mg/L SO2下仍可正常生长,具有一定的SO2耐受能力。

单宁可与酵母蛋白质和相关酶系反应,从而阻碍生长[20]。随着单宁浓度的升高,N1生长受到抑制导致菌落直径减小;N1在单宁质量浓度为32 g/L时仍能生长,属于高耐单宁酵母(图4-d)。

2.4 单宁降解试验

部分微生物可在含有单宁的环境中稳定增殖,并分泌单宁酶将单宁降解,包括细菌、霉菌、酵母等[21]。依照单宁标准曲线及降解率公式计算,结果见图5。

a-单宁标准曲线;b-单宁含量及降解率

随着发酵时间的延长,样品中单宁含量先上升后下降(P<0.05)。相比对照组,处理组N1在发酵第2天单宁含量开始下降,这与发酵前期N1迅速增殖有关。发酵第5天时,单宁含量降至最低,降解率达到最高为40.01%。

2.5 刺梨果酒发酵试验

2.5.1 发酵力测定

酵母的发酵性能与起酵速率有关,起酵速度越快,酵母转化能力越强[22]。以SY(酿酒酵母)为对照,绘制发酵时间与质量损失的关系曲线,结果见图6。N1起酵速率快,在24 h进入发酵旺盛期。发酵后总失重量为20.15 g,质量损失主要集中在前期,这与蒲鹏飞[23]对海红果酒发酵分析结果一致。在发酵10 d时失重趋于稳定,在15 d时发酵基本结束。

图6 各菌株发酵过程失重曲线

2.5.2 理化指标分析

发酵指标测定结果见表2。N1发酵液酒精度为9.23%vol低于SY,这与一般认为非酿酒酵母产酒能力普遍低于酿酒酵母的结论一致。酯类物质是果酒重要的风味物质[24]。N1总酯更高,为1.36 g/L,含有更多的香味物质;酸类物质在果酒中可以丰富果酒品质,提升口感。N1总酸为6.02 g/L,发酵液整体总酸偏高,这可能与刺梨维生素C含量高有关。对糖的利用能力能够反映菌种的发酵效能,残糖越低,效能越高[25]。N1残糖量为4.31 g/L,发酵效能良好;干浸出物与果酒原料及发酵方式有关,干浸出物含量越高则果酒品质越高[26]。N1干浸出物质量浓度为57.1 g/L,符合高品质标准。结合酒精产量、产酯及糖利用率等情况可知,N1发酵性能良好。

表2 菌株N1发酵第10天理化指标

2.6 刺梨果酒电子鼻风味分析

2.6.1 电子鼻风味物质的响应雷达图与传感器贡献率分析

非酿酒酵母与酿酒酵母相比,参与发酵会分泌各种脂肪酶、蛋白酶、糖苷酶等酶系,产生各种高级代谢产物,提高果酒风味的复杂性[24]。由图7可知,N1在传感器W1W、W1S、W5S响应值明显高于SY,产生更多烯烃类、甲基烷烃类、氮氧化合物等成分。N1雷达图整体类似SY,与KB有明显差异。载荷图中总贡献率为99.5%。W1S传感器对第一主成分的贡献率最大,为甲基烷烃类物质;W2S传感器对第二主成分的贡献率最大,为醇类物质。传感器W1S、W1C、W3C的敏感性高,风味贡献率较大,表明发酵液主要风味为烷烃类、芳香苯类、芳香胺类。

a-响应雷达图;b-传感器载荷分析图

2.6.2 主成分分析法

利用PCA表示各样品风味与电子鼻结果的关系,结果见图8。第一主成分和第二主成分贡献率分别达到了90.6%和8.9%。N1分布于第四象限,SY分布于第一象限。N1与SY在第二主成分呈负相关,风味占比不同,具有一定的差异性。表明电子鼻可以有效区分不同菌株的风味物质组成,具有可靠性。

图8 N1、SY、KB电子鼻数据PCA图

3 讨论

传统酵母资源库已无法满足各类特色果酒开发,酵母选育已是果酒发酵最重要的环节之一。目前,从水果发酵液中筛选野生酵母,提高果酒的发酵品质,依然是主要的筛选方式。吴德光等[25]从三华李中分离出酿酒酵母,具有高产酒精的发酵潜力。杜亚军等[27]从红枣中分离出一株酿酒酵母,发酵酸度低且产香丰富,解决了枣酒残糖较高、缺少风味等共性问题。大部分水果中含有酸类、酚类、皂苷类等各种抑菌类活性物质,传统酵母缺乏一定的耐受能力,从而影响酵母增殖致使发酵效果降低。目前,对于高耐受性酵母的选育,提高水果的开发潜力,对产业升级改革具有实际意义。

贝氏酵母(Saccharomycesbayanus)是一种常用于果酒发酵的非酿酒酵母菌,通过释放酶和香气成分来增强果酒的多样性和复杂性[28]。LIU等[29]发现,贝氏酵母不仅可提高辛酸乙酯和己酸乙酯的气味活性值,还可与酿酒酵母共培养增加癸醇和萜烯-4-醇等特征风味含量。JANUSZEK等[30]利用贝氏酵母发酵苹果白兰地,产生更多高级酯类、β-葡萄糖苷酶等活性成分。KANPIENGJAI等[10]研究表明,非酿酒酵母在单宁质量浓度≥30 g/L时生长状态优于酿酒酵母,表现出更高的单宁耐受能力,与本研究结果一致。贺红早等[31]利用贝氏酵母进行刺梨果酒发酵,整体评价高于酿酒酵母、孢圆酵母。本研究也发现,N1在总酯、干浸出物含量等方面均优于酿酒酵母,风味组成更加丰富。KELLY等[32]利用贝氏酵母和酿酒酵母发酵脱水葡萄发现,2种酵母产醇水平相似,贝氏酵母可减少酒中的氧化物,提高色素浓度。本研究也发现,贝氏酵母虽属非酿酒酵母,也具有较好的产醇能力。

4 结论

本研究从高单宁水果中分离筛选获得一株发酵良好、风味突出的酵母菌株N1,经鉴定为贝氏酵母。N1能够耐受32 g/L单宁和降解40.01%的单宁,具有良好的高单宁水果利用能力;N1发酵刺梨酒酒精度9.23%vol,总酯质量浓度为1.36 g/L,具有良好的产酒产香能力;对刺梨酒进行电子鼻风味测定,烷烃类、芳香苯类、芳香胺类物质贡献主要风味。N1具有发酵高单宁水果的潜能,但仍需要进行大量的基础与应用研究,进一步验证N1菌株产酯能力和产香机制,或进一步驯化、育种提高发酵能力。此外,N1与酿酒酵母混菌发酵具有可实践性,是否适用于其他高单宁水果发酵还有待研究。对于耐单宁酵母的筛选,既丰富了酵母资源库,也为后续的实际工业生产提供了可靠思路。