铜依赖性细胞死亡及铜在乳腺癌治疗中的研究现状

文世超 综述 王静萱 审校

铜是一种重要的金属元素,参与多种生物过程,包括线粒体呼吸和抗氧化等,铜离子动态平衡紊乱会引发氧化应激[1],引起相关细胞损伤而诱发某些疾病,如威尔逊病(Wilson′s disease)[2]。“铜死亡(Cuprotosis)”是2022年由Tsvetkov等[3]首次提出的一种铜依赖的、新型细胞死亡方式,研究表明,铜死亡参与多种肿瘤的发生、侵袭和转移,包括乳腺癌和宫颈癌等,而且与恶性肿瘤的治疗密切相关。目前,乳腺癌已位于全球女性恶性肿瘤之首[4]。研究发现,不平衡的微量元素与乳腺癌的发生有关[5],已证实乳腺癌患者体内的铜水平较高,并且与乳腺癌的发生发展相关。本文就铜依赖性细胞死亡的发生机制及铜在乳腺癌治疗中的研究现状作一综述。

1 铜的分布与代谢过程

铜是人体必不可少的微量元素,仅次于铁和锌位于第三位,主要从食物中摄取,在肠道中被吸收,大部分存在于肌肉和骨骼(50%～70%),约20%分布在肝脏,其余存于血液等[6]。成人体内约含有100～200 mg铜,进入血液中的铜与血清白蛋白结合,转运至人体各器官,存储于肝脏,最后经胆道排泄。铜主要以Cu+和Cu2+两种形式存在,胞外的Cu2+与二价金属转运体1(Devalent mental transporter1,DMT1)结合,经还原酶还原为Cu+,再由跨膜铜转运体1(Copper transporter1,CTR1)转运进入细胞内[6-7]。CTR1是负责饮食铜摄取到肠上皮的主要转运体,由肠道吸收的Cu+通过铜伴侣蛋白抗氧化物1(Antioxidant 1 copper chaperone,ATOX1)转运至高尔基体内,结合铜转运ATP酶α(Copper-transporting ATPase alpha,ATP7A)后泵入门静脉循环,储存于肝脏。因此当铜缺乏时,ATP7A将发挥作用。另一种铜转运ATP酶β(Copper-transporting ATPase beta,ATP7B)作用于铜,使其装载到铜蓝蛋白上。铜蓝蛋白是血浆中分泌的铜氧化酶,在调节铜在机体的分布、合成含铜的酶蛋白等方面至关重要[8]。ATP7B可以防止铜过量,将多余的铜转运至胆汁,然后通过粪便排出或在消化道重吸收[9]。

2 铜依赖性细胞死亡的发生机制

细胞死亡分为意外性细胞死亡(Accidental cell death,ACD)和调节性细胞死亡(Regulated cell death,RCD),其中RCD包括细胞凋亡、焦亡、坏死性凋亡、自噬和铁死亡[10]等。不同于之前的RCD形式,Tsvetkov等[3]提出“铜死亡”是一种依赖于细胞内铜的聚集,新型的细胞死亡方式。细胞内的铜与线粒体三羧酸(Tricarboxylic acid,TCA)循环中的酯酰化的蛋白质结合,经酯酰化的蛋白质聚集后铁硫簇蛋白丢失,使蛋白质发生毒性应激最后导致细胞死亡。铜离子载体是一种可以与铜结合的小分子,先前发现的伊利司莫通过与Cu2+结合形成复合物进入细胞,进入细胞内的Cu2+在铁氧化还原蛋白1(Ferredoxin 1,FDX1)的作用下还原为具有毒性的Cu+,导致细胞死亡[11-12]。Tsvetkov团队[3]发现伊利司莫单独应用或者加入其他金属均不会影响细胞生长,然而当铜离子加入时,胞内铜的积累,会使细胞生长被抑制,这说明铜离子载体诱导的细胞死亡主要为铜依赖性细胞死亡。

研究者们发现与依赖糖酵解的细胞相比,依赖线粒体呼吸的细胞对铜离子载体的敏感度是前者的1 000倍左右,缺氧条件也能使铜死亡减轻,此外,采用抑制线粒体功能药物后,细胞对铜离子载体的敏感性的影响非常明显,这说明铜死亡主要依靠于线粒体的呼吸,同时线粒体解偶联剂的应用发现对铜毒性无显著影响,这证实铜死亡并非依赖三磷酸腺苷的产生。

通过对全基因组CRISPR-Cas9功能丧失筛选,研究者们瞄准了铜诱导死亡的关键基因FDX1[13],其被伊利司莫直接靶向,将Cu2+还原为Cu+,其他铜死亡相关基因,包括硫辛酸合成酶(Lipoic acid synthetase,LIAS)、酯酰转移酶(Lipoyltransferase,LIPT1)、二氢硫辛酰转乙酰基酶(Dihydrolipoamide S-acetyltransferase,DLAT)等[14]。对FDX1、LIAS进行基因敲除后可以增加对铜死亡的抵抗力,进一步说明FDX1、蛋白质酯酰化与铜死亡之间的关系。同样,在糖酵解的环境下,大多数铜离子载体丧失杀伤功能,再次证实这个过程依赖于线粒体的代谢。蛋白质酯酰化是一种高度保守的赖氨酸翻译后修饰[15],仅发生在四种酶且都参与调节碳开启TCA循环的入口的代谢复合物,这些蛋白质的酯酰化促成了酶促反应。研究者发现通过敲除FDX1或酯酰化相关酶可以阻止铜死亡[16]。为了证实,Tsvetkov等[3]先通过数据库发现FDX1和硫辛酸通路的成分与细胞活力高度相关。然后对208例肿瘤标本进行FDX1和硫辛酸的免疫组化染色,验证了FDX1与酯化蛋白表达相关,且FDX1敲除会导致完全丧失蛋白质酯酰化,同时细胞呼吸也显著下降,因此证实FDX1是蛋白质酯酰化上游调控因子并参与铜死亡。另一方面,研究发现铜与酯酰化的蛋白质直接结合导致DLAT的酯酰化依赖性寡聚化,使铁-硫簇蛋白丢失诱导蛋白质毒性应激,最终导致细胞死亡[3]。

此前,没有明确的数据指明铜死亡对三阴性乳腺癌存在影响,Sha等[17]发表的关于铜死亡相关基因(Cuproptosis-related genes,CRGs)在三阴性乳腺癌预后中的研究,包含16个CRGs,通过记录CRGs在乳腺癌中的拷贝变异数(Copy number variation,CNV)和体细胞突变的发生率分析,证实了CRGs的失衡在对乳腺癌的侵袭和转移中有重要作用。通过风险评分计算风险中位数将患者分为低风险组和高风险组,低风险组患者的生存时间更长,预后更好,而高风险组的患者更容易发生免疫抑制。CRGs对三阴性乳腺癌的预后存在预测作用,因此,铜死亡在乳腺癌治疗中的研究值得深入探索。

3 铜在乳腺癌治疗中的研究现状

3.1 铜配合物在乳腺癌治疗中的研究

目前,临床中乳腺癌的治疗主要以手术、化疗、放疗、靶向和免疫治疗等为主[18],但传统的治疗常会产生耐药,因此正在探索新兴的治疗手段。铜参与肿瘤细胞增殖、血管生成和转移[19],许多研究发现,肿瘤患者体内的铜水平高于健康人群[20],包括乳腺癌、宫颈癌和口腔癌等。因此铜被认为是一种新的抗肿瘤治疗靶点,20世纪60年代,铜配合物的抗肿瘤活性第一次被Booth团队提出[21]。

铜配合物目前主要有铜络合剂和铜离子载体两种类型[22]。前者是与铜离子结合,降低其生物利用度,减少肿瘤细胞中铜离子的含量发挥抗肿瘤作用[23]。美国安德森癌症中心使用铜络合剂联合卡铂治疗卡铂耐药的卵巢癌患者,证实铜络合剂可能是克服铂耐药的关键[24]。而后者铜离子载体则将铜转移到细胞内,增加胞内铜离子水平,产生活性氧,激活氧化应激,引起相关细胞的损伤,诱导癌细胞凋亡[25]。来自美国杜克大学医学中心的一项研究发现双硫仑(Disulfiram,DSF)作为铜离子载体诱导铜发生氧化应激,介导炎性乳腺癌发挥抗肿瘤作用[26]。双硫仑是一种酒精戒断药物,作为氧化还原调节剂,它与Cu2+结合形成双硫仑-铜复合物(DSF-Cu)[27],使胞内铜离子含量增加,DSF-Cu能拮抗NF-kB信号[28]、醛脱氢酶活性和抗氧化水平,诱导氧化应激,使多种乳腺癌细胞凋亡,因此,DSF可以显著抑制乳腺癌生长,可能是乳腺癌治疗的新思路。

3.2 铜依赖蛋白在乳腺癌治疗中的研究

在最近的一项Meta分析中,Feng的团队纳入36项研究共5 747例患者,其中2 369例乳腺癌患者,其余为良性乳腺疾病组和健康对照组,通过监测血清铜水平,得出乳腺癌组血清铜水平明显高于其他两组(P<0.001)[29],一部分因为铜是肿瘤细胞增殖的细胞启动子,另一原因是在乳腺癌组织中,铜依赖蛋白的表达上调。铜依赖蛋白已被证明可以刺激血管生成及肿瘤的转移,包括细胞运动介质1(Mediator of ErbB2-driven cell motility 1,MEMO1)[30]、溶质载体家族3成员1(Solute carrier family 3 member 1,SLC31A1)[31]、ATOX1[32]和赖氨酰氧化酶2(Lysyl oxidase like 2,LOXL2)[33]。

Karginova等[34]研究发现铜和一些铜依赖性蛋白是新兴治疗靶点。DCAC50是一种胞内铜伴侣蛋白的小分子抑制剂,可以减少肿瘤细胞增殖并提高氧化应激,从而使三阴性乳腺癌细胞凋亡。DCAC50抑制ATOX1活性与破坏铜稳态,导致细胞内铜水平升高[32]。试验结果发现在异种移植的小鼠模型中,DCAC50可以减缓肿瘤的生长速度同时抑制血管生成;在体外可以阻止内皮细胞网络的形成,其与紫杉醇的联用可以增强三阴性乳腺癌的细胞毒性,同时可减少两种药物使用剂量,因此抑制胞内铜的转运是治疗乳腺癌的潜在疗法。

3.3 其他铜相关因素在乳腺癌中的研究

铜稳态相关基因(FOXO1)促进含铜蛋白的表达,在维持铜平衡中发挥重要作用,同时FOXO1与肿瘤发生有关,包括乳腺癌和卵巢癌[35]等。Zeng等[36]研究发现FOXO1在乳腺癌中显著下调,并且FOXO1高表达的乳腺癌患者预后良好,此外还发现其表达水平可能影响免疫治疗的反应,因此可将FOXO1作为乳腺癌患者治疗的新方向。

此外,铜介导的肿瘤局部光疗法在乳腺癌治疗也初步得到证实[37]。在小鼠试验中,Shrestha等[38]发现,新型光敏剂铜半胱胺纳米粒子激活后可使小鼠的乳腺癌肿瘤组织明显减小,尽管目前暂时无相关的人体试验数据支撑,但可以预期的是光疗可作为乳腺癌的一种治疗。除以上之外,铜介导的其他疗法的研究也正在进行中,如化学动力学疗法(Chemodynamic therapy,CDT)[39]和联合免疫治疗[40]等。

4 小结与展望

铜参与线粒体呼吸、铁吸收等重要的细胞代谢,维持铜的动态平衡对机体的健康至关重要,铜动态平衡紊乱可诱发多种疾病,包括心血管疾病和恶性肿瘤等。铜死亡作为一种新型细胞死亡方式,依赖于细胞内铜聚集,通过铜与线粒体TCA循环中酯酰化的蛋白质结合后聚集,铁硫簇蛋白丢失,蛋白质毒性应激最后导致细胞死亡。研究表明,铜死亡与乳腺癌和宫颈癌等恶性肿瘤的发生、侵袭和转移有关,同时作为一种新兴的抗肿瘤治疗靶点,铜死亡在乳腺癌的治疗应用中也有所突破。尽管目前尚未在临床中广泛应用,但铜络合剂、铜离子载体、铜伴侣蛋白抑制剂及铜相关联合方案等已经在乳腺癌的治疗中展开研究。未来,我们可以通过进一步对铜死亡在乳腺癌中作用机制的研究,研发靶向铜死亡的乳腺癌治疗新药物,通过不同的机制达到抗肿瘤目的。