海南不同成熟期诺丽果的蛋白鉴定及功能分析

邱静 宋媛 王妮 王佳人 陈静 陈光英 赵振东 何文英

摘 要：诺丽果（noni）是海南的一种特色水果，具有多种药效价值，但关于其植物蛋白的研究却很少。本研究采用基于BPP+酚提取法的双向电泳技术，通过优化实验条件，对花蕾期、半成熟及成熟期等3 个时期产自海南的诺丽果实进行蛋白质的提取分离，获得其植物蛋白指纹图谱；利用Image Master 5.0 软件分析凝胶图像筛选出高表达蛋白；再利用MALDI-TOF-MS 技术对这些蛋白酶解产物进行质谱鉴定；通过生物信息学手段对3 种诺丽果实的高表达蛋白初步进行蛋白功能分析。结果表明：花蕾期、半成熟及成熟诺丽果实分别有44、49 和40 个高表达蛋白，通过质谱鉴定，确定了其中分别有33、22 和39 个蛋白，从属不同植物功能的蛋白种类；不同成熟期的高表达蛋白差异较大，涉及叶绿体连接酶、半胱氨酸蛋白酶、蛋白激酶、泛素连接酶、生长素反应因子等多种蛋白质。该研究为进一步开发利用诺丽果的植物蛋白提供科学合理的理论指导。

关键词：诺丽果；不同成熟期；蛋白；功能分析

中图分类号：S759.83 文献标识码：A

诺丽（Noni）即海巴戟（Morinda citrifolia L.），又名热带海巴戟、海巴戟天、四季果等，属茜草科巴戟天属植物，是一种生长于热带及亚热带的多年生常绿阔叶灌木或小乔木，波利尼西亚土著将诺丽作为民间药物使用已有2000 多年历史，民间多用于治疗发烧、腹泻、便秘、哮喘、恶心呕吐、蚊虫叮咬及动物咬伤引起的感染等疾病[1-2]。

诺丽植株的多部位含有多种活性成分，近年来已从诺丽的根、茎、叶、花、果实、树皮、芯材等部位分离鉴定了300 余种化合物，主要包括黄酮、多糖、香豆素、蒽醌、环烯醚萜、生物碱、木脂素、香豆素、三萜、甾醇等化学成分[3]。现代药理学研究表明，诺丽具有抗炎、抗癌、抗氧化、抗焦虑、抗抑郁、降血脂、降血糖、肝保护、改善记忆、提高耐力、提高免疫力、减轻骨质疏松症、改善关节疼痛及活动度、对缺血性神经元损伤的保护作用、多巴胺双向调节等作用[4]。作为一种传统药食同源的植物，诺丽果实也是一种特色的热带水果，据报道，其中含有275 种以上的营养成分，除含抗氧化物、东莨菪碱、多醣体、及罕见的对人体健康非常重要的17 种虹甙类（环烯醚萜类）等化学成分以外，还包括人体所需的20 种必需氨基酸、9 种人体内无法自行生成的必需氨基酸；另含有丰富维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B3、叶酸等14 种维生素，含有钾、钠、锌、钙、铁、镁、磷、铜和硒等16 种矿物质，硒含量为其他水果的10 倍以上[5-7]。

由于诺丽的高营养价值，早在2010 年诺丽果浆被中华人民共和国卫生部列入了新资源食品名单，诺丽种植在我国海南省和云南省已具备一定规模[3]。通过追踪不同产地诺丽果关键发育期主要活性物质的动态变化，不仅为诺丽果原材料的实时采收、质量控制以及缩短诺丽产品生产成本与周期提供科学依据[8]，也可对不同成熟度诺丽果进行主要活性成分分析。国内最新报道了云南产诺丽果不同成熟度诺丽果中多糖、总黄酮、总酚、总蒽醌、莨菪亭、总皂苷、桃叶珊瑚苷、蛋白质含量测定的研究，结果表明成熟度与活性成分间具有一定的相关性[8]。

国外也有较多关于诺丽果实及种子的种植、营养价值、药理活性及机制的研究[9-11]。通过查阅国内外文献，发现虽然有较多关于诺丽化学成分提取及其生物或药理活性的研究，但还未见有诺丽不同成熟度的蛋白提取及其指纹图谱的建立或其中功能蛋白发现分析的报道。作为一种有较高营养价值及药理活性的药食同源植物，研究其所含植物蛋白名称、发现与其药物活性相关的关键蛋白，对深度了解诺丽果实、指导育种、进一步开发诺丽果实均具有非常重要的理论和实际意义。本研究利用蛋白质组学的双向电泳技术[12]，获得海南不同成熟期的诺丽果蛋白图谱，并利用生物质谱及生物信息学技术，鉴定分析諾丽果关键发育期主要蛋白质的动态变化，为进一步深入研究和开发诺丽果提供科学合理的指导。

1 材料与方法

1.1 材料

花蕾期、半成熟及成熟诺丽果果实样品，均采集于海南海口东山镇诺丽果种植园（20°02′45.97″N，110°11′38.39″E），经海南师范大学生命科学院的陈玉凯副教授鉴定确为花蕾期、半成熟及成熟诺丽果果实（图1）。将采集回来的花蕾期、半成熟及成熟诺丽果样品用超纯水清洗干净，用锡箔纸包裹住放入保鲜袋中，于–80 ℃的冰箱中保存备用。

蛋白提取仪器及试剂：台式恒温振荡器（精宏）；QL-866 涡旋混合器；SIGMA3-18K 低温超速离心机（德国SIGMA）；超纯水系统（上海和泰）；EYELA 摇床（东京理化）；蛋白质等电聚焦仪（Ettan IPGphor3）， 固相pH 梯胶条（pH3～10）；Image scanner III 扫描仪（美国通用公司GE Healthcare）；Image Master 5.0 凝胶图像分析软件；MultiTemp IV 恒温循环器；UV-2700 紫外分光光度计（日本岛津）；KQ2200E 型超声波清洗仪（曙峰企业）；GM-0.33A 型隔膜真空泵（津腾）；Voyager-DE PRO ABI4700 时间飞行质谱仪（美国ABI 公司）。所有试剂均为国产分析纯试剂，所有实验用水为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 BPP+酚抽提法提取蛋白 （1）取出样品，切成小块， 置于预冷的干净研钵中， 加入少许 PVPP 粉末和少许二氧化硅粉末，在液氮环境中研磨到粉末状；称取3 g 研磨好的样品粉末，加入至10 mL 离心管中，再加入10 mL BPP 提取缓冲液，充分涡旋震荡10 min；再加入10 mLTris饱和酚，涡旋10 min；在SIGMA3-18K 低温超速离心机中离心15 min（4 ℃，转速：16000×g）；移取上层清液转移至干净离心管中，加入5 mLBPP 提取缓冲液，涡旋震荡10 min 后离心15 min；再移取3 mL 上层清液转移至干净离心管中，加入15 mL 预冷过饱和硫酸铵甲醇溶液（AM 沉淀剂），置于–20 ℃冰箱中沉淀12 h 以上；从冰箱中取出离心管，用 AM 沉淀剂配平后离心15 min弃上清液；每管再加入2 mL 预冷甲醇，去上清液，涡旋均匀，重复2 次；再分别加入 2 mL 预冷丙酮，重复2 次转移及离心步骤；去除上清液，分别加入适量DTT，混合均匀，按10 mg/mL 加入适量裂解液，于20 ℃恒温溶解2 h 以上；待蛋白完全溶解到裂解液后，离心，取上清液，测定蛋白浓度。

（2）标准曲线法测定蛋白质含量。称取1 mg牛血清蛋白充分溶解于1 mL 超纯水中，配制成1 mg/mL 的标准牛血清蛋白储备液。分别准确量取1 mg/mL 的标准牛血清蛋白储备液若干体积，用超纯水配制成0、2、4、6、8、10 μg/mL 的牛血清蛋白标准溶液。利用紫外分光光度计，测定在595 nm 处的吸光度值，根据朗伯-比尔定律，以牛血清蛋白标准溶液的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，制作标准曲线。

1.2.2 蛋白质含量测定 采用Bradford 法测定样品的蛋白浓度[13]， 使用紫外分光光度计， 在595 nm 的波长下测定花蕾期、半成熟及成熟诺丽果蛋白提取液的紫外吸光度值，根据标准曲线方程，计算样品中蛋白质的含量。

1.2.3 单向电泳实验 根据吴秀丽等[14]的方法进行单向电泳实验，确定双向电泳的最佳上样浓度。

1.2.4 双向电泳实验 移取含有1.3 mg 蛋白质的提取液，用蛋白裂解液稀释至样品体积为455 μL，加5 μL IPG Buffer 于离心管中，轻轻震荡使其混合均匀，转移至IPG 胶条（pH 3～10）上，20 ℃恒温水化18 h 以上；保持室温20 ℃左右，设置聚焦极限电流为每根胶条50 μA，电压参数如表1所示，进行一向等电聚焦；再将胶条放置在摇床上平衡15 min；在制备好的聚丙烯酰胺凝胶上进行二向垂直电泳操作，设置参数为：每张胶片5 W进行预电泳1 h，每张胶片7 W 至电泳结束；再进行凝胶染色和脱色、凝胶扫描和用ImageMaster 软件分析凝胶图谱[14]，筛选出高表达的蛋白并进行编号。

1.2.5 生物质谱鉴定及分析 挖取高表达蛋白质，分别用150 μL 超纯水、150 μL 脱色液和100μL 乙腈处理，放置在摇床上摇荡30 min，转速设置为150 r/min，摇荡后吸出离心管中的水，以上步骤重复3 次，直至蛋白粒变为无色，置于室温下风干；将蛋白样品离心后加入适量胰蛋白酶，放置在4 ℃冰箱中1 h 左右；再将其放置在PCR 仪上酶解蛋白（37 ℃，13 h）；设置转速7000×g，离心5 min（20 ℃），备用；利用MALDI-TOF-MS进行蛋白鉴定；将所得的质谱数据通过MascotDistiller 软件进行分析，再利用Matrix Science（http：//www.matrixscience.com）网站进行搜库比对，确定蛋白的名称、种类及其他信息。

2 结果与分析

2.1 不同成熟期诺丽果蛋白提取

通过Bradford 法测定3 种诺丽果的蛋白浓度，在波长为595 nm 处通过测定系列梯度浓度的标准牛血清蛋白溶液的吸光度值，建立标准曲线方程（未显示），计算得出花蕾期、半成熟及成熟诺丽果蛋白溶液的浓度分别为6.808、11.30、5.89 mg/mL。

为获得双向电泳合适的上样浓度，进行单向电泳实验，结果如图2 所示。不同成熟期诺丽果的蛋白分子量介于15～130 kDa 之间，花蕾期的蛋白主要在17、20、25 kDa 左右，半成熟期的蛋白主要在17、20、33 kDa 左右，而成熟期的蛋白则主要集中在15、20、25、33 kDa 左右。另外，从图2 可以清晰看出样品的蛋白条带，说明不同成熟期诺丽果实蛋白质未降解，可以进行后续双向电泳实验操作。

在优化实验条件下，通过双向电泳实验可以得到清晰明顯、分离效果很好的蛋白凝胶图谱，再经ImageMaster 软件分析在蛋白凝胶图谱上标记高表达的蛋白点。花蕾期、半成熟及成熟诺丽果实分别有44、49 和40 个高表达蛋白（图3）。

2.2 不同成熟期诺丽果蛋白质谱鉴定

将不同成熟期诺丽果中的若干高丰度蛋白质点，经过挖点、酶解和提取处理后，利用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱仪（MALDITOF-MS）对其进行分析和鉴定，并设置参数以基质峰、酶自切峰进行校正，测定各蛋白肽段的质谱数据，再通过植物蛋白质数据库进行对比来确定这些蛋白的名称、种类等信息，最终成功鉴定出花蕾期有33 个蛋白点、半成熟期有23 个蛋白点、成熟期有39 个蛋白点，结果分别如表2、表3 及表4 所示。

2.3 不同成熟期诺丽果蛋白功能分析

以上通过利用双向电泳实验和MALDI-TOFMS生物质谱技术，对海南不同成熟期的诺丽果实中植物蛋白的提取和鉴定实验，成功匹配了花蕾期、半成熟及成熟诺丽果实分别有44、49 和40 个高表达蛋白，通过质谱鉴定，相应确定了分别有33、49 及39 个蛋白，从属不同植物功能的蛋白种类，对这些差异表达的蛋白进行了简单的生物学功能分析，详见表5～表7。花蕾期和半成熟期相同的蛋白有：硫氧还蛋白、驱动蛋白、叶绿体、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、蛋白连接酶、Squamosa 启动子结合样蛋白、转录因子；花蕾期和成熟期相同的蛋白有：转移酶、可能的抗病蛋白、F-box 蛋白；半成熟期和成熟期相同的蛋白有：蛋白短梗、半胱氨酸蛋白酶、转移酶、叶绿体、蛋白质Ycf2。

3 讨论

诺丽果不同成熟期的蛋白相差较大，表现在众多的生长、发育及遗传功能方面。花蕾期的23号根向光蛋白与半成熟期的31 号光敏色素均与植物的光感应相关，由于开花是植物从营养生长到生殖生长的一个重要转折点，直接影响着种子植物生育期的早晚、授粉及种子发育的最佳时期，这暗示不仅可通过人为调节光的某些特性来调控花蕾期诺丽果的根向光蛋白，从而促使花蕾期诺丽果尽快开花，也可从不同成熟的诺丽果提取根向光蛋白并用于科学培植诺丽果[91]。此外，发现花蕾期的8 号蛋白枯草杆菌蛋白酶[92]、18 号蛋白可能的抗病蛋白RPP1[93]与成熟期的19 号抗病蛋白Pik-1[94]，均与植物抵抗病菌相关，也表明这3种抗病蛋白可有望开发为高效、低毒的生物农药。

本研究发现部分蛋白与动物体内的蛋白相同，具有不同的生物学或药学功能，如花蕾期的1、28 号蛋白和半成熟期的34 为硫氧还原蛋白，作为一种小的热稳定酸性蛋白，是细胞中重要的氧化还原蛋白，具有调节细胞抗氧化、抗胁迫、细胞凋亡、DNA 结合转录因子活性等功能，说明在诺丽果花蕾期到半成熟期的发育过程中，可能在抗氧化应激、阻止线粒体介导的细胞死亡、调节某些基因的表达等方面起关键作用[15]；作为人体重要的内源性抗氧化系统之一，硫氧还原蛋白被研究证明具有出色的抗氧化活性或调节众多细胞生存相关信号通路，从而抵抗活性氧损伤[95]。

花蕾期的2 号、成熟期的24 号蛋白为驱动蛋白，作为一类重要的微管调节蛋白，可能在诺丽果的神经元的发育、纺锤体的组装和染色体的分离过程中起着重要的作用[16]，人体驱动蛋白是分子马达的一种，其通过结合和水解ATP，导致颈部发生构象变化，促使驱动蛋白沿着微管“行走”，完成细胞中货物运输的工作，能为细胞生命活动提供动力[96]。花蕾期中编号6、20、24 和29 均为蛋白连接酶，其中编号6 和20 为E3 泛素蛋白连接酶，其广泛参与细胞内的代谢过程，比如细胞增殖、细胞周期调控、细胞的凋亡，人体这些酶的调节异常与多种疾病有关，如神经系统疾病与恶性肿瘤等[23]。编号24 和29 为生物素蛋白连接酶，通过调节微生物的乙酰辅酶A 羧化酶和丙酮酸羧化酶，控制重要代谢途径的关键反应，从而有效控制微生物生长，也是极具开发前景的抗菌新靶点[24]；花蕾期的18、成熟期的19 抗病蛋白能识别病原体及微生物，并触发免疫，对抗病原体以及微生物的侵扰[35]。花蕾期17、成熟期的34 号为F-box 蛋白，作为泛素连接酶复合物SCF的重要组成物，可能参与调控诺丽果的整个细胞周期，对人体诊治肿瘤以及生殖方面的疾病也有重要的作用[34]。成熟期的8 号天冬酰胺酰β-羟化酶是一种能催化L-天冬酰胺水解生成L-天冬氨酸和氨的酰胺基水解酶，广泛存在于植物、动物和微生物中；人类天冬氨酰参与并调节恶性肿瘤细胞的侵袭及转移，在多种恶性肿瘤中过表达，参与并调节恶性肿瘤细胞的侵袭及转移，并可介导抗肿瘤免疫反应，在肿瘤靶向治疗、免疫治疗中的作用逐渐受到重视[67]。成熟期的10 级12 号蛋白为钙依赖性蛋白激酶，在Ca2+介导的信号转导中起重要作用，可能参与调控成熟期诺丽果的植物激素信号通路、生物胁迫反应及其根、茎、叶或种子发育等过程[69]；人体钙依赖性蛋白激酶对胆管癌细胞HuCCT1 血管的生成有一定的影響和调控[97]。半成熟期的10、13、14、16、18、19、20、21、22 和成熟期的29 号为半胱氨酸蛋白酶，是植物中重要的蛋白酶家族之一，可能参与半成熟期和成熟期诺丽果种子萌发、幼苗发育、胁迫响应和组织分化衰老等过程[46]；人体半胱氨酸蛋白酶抑制剂S 对于胃癌的鉴别具有重要作用，对极有可能作为新的肿瘤标志物以及它对于胃肠癌诊断具有极其重要的参考价值[98]。

诺丽果是一种药食同源的植物，虽然大部分现有的研究是关于诺丽果不同部位化学成分的提取及在营养食品等方面的应用，但从蛋白质组学的方法挖掘诺丽果的科学及实用价值的国内外研究却很少有。本研究用蛋白质组学揭示了不同成熟期果实的蛋白种类及功能，以上结果表明在不同成熟期的诺丽果中大多数蛋白、激素以及酶均存在着药学作用，在一定程度上可补充说明诺丽果的药理活性，对后续深入了解诺丽果实、指导育种以及进一步开发诺丽果实提供理论依据。

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