南药阳春砂、草豆蔻挥发油抑菌活性研究

魏洁书，胡锦珊，洪群华，邱远琦，刘禹辰，罗育文，张素中

（广州新华学院，广东广州 510520）

南药，是指我国秦岭以南地区生产的药材，常指生长于南方五岭山脉以南的广东、广西、海南3 省（区）的陆地和海岛的中药[1]。南药是中药资源的重要组成部分，资源种类繁多，含有多种有效成分，且大多具有挥发油成分[2]。多数南药中的挥发油成分具有抗菌作用，如砂仁、肉豆蔻、八角茴香等[3-5]。

阳春砂和草豆蔻均为著名南药。阳春砂为姜科（Zingiberaceae）植物阳春砂（Amomum villosumLour.）的干燥成熟果实，能化湿开胃，温脾止泻，理气安胎。草豆蔻为姜科植物草豆蔻（Alpinia katsumadaiHayata.）的干燥近成熟种子，能燥湿行气、温中止呕。挥发油是阳春砂和草豆蔻发挥药效的主要成分[6]。目前，阳春砂果实与叶片中所含有挥发油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌抑菌活性的差异性尚不明确，草豆蔻果实及叶片挥发油的抑菌活性鲜有报道。

本文拟提取阳春砂、草豆蔻2 种南药不同部位的挥发油进行体外抗菌药效实验，初步研究2 种南药对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌三种常见菌株的抑菌效果，为其抑菌活性在食品、药品研究中的开发及应用提供参考，同时为阳春砂和草豆蔻非药用部位的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

阳春砂（Amomum villosumLour.）、草豆蔻（Alpinia katsumadaiHayata.）植株采自广州新华学院广州校区药用植物园，干燥成熟果实购自广州集芝宝中药有限公司，由广州新华学院药学院张素中教授鉴定。

菌种：大肠杆菌（Escherichia coli，ATCC25922）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC6538）来自广东环凯微生物科技有限公司；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，BNCC109047），来自北京北纳创联生物技术研究院。

LB 琼脂培养基、营养琼脂培养基，广东环凯微生物科技有限公司；链霉素（C014）和青霉素（C001），杭州滨河微生物试剂有限公司。

BHC-1300 ⅡA/B 生物洁净安全柜，上海苏净实业有限公司；GF54DA 立式自动压力蒸汽灭菌锅，致微（厦门）仪器有限公司；GSP-9160MBE 电热恒温培养箱（隔水式），上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DMF-20A 摇摆式高速中药粉碎机，浙江温岭市铭大药材机械设备有限公司；YP60IN 电子分析天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；TC-15 套式恒温器，近湖镇教学仪器厂。

1.2 挥发油提取

1.2.1 阳春砂、草豆蔻阴干叶片挥发油提取

（1）摘取阳春砂新鲜叶片，洗净、阴干，用摇摆式高速中药粉碎机适当粉碎后按1.0 ∶13.3（g ∶mL）的投料比加入蒸馏水，于挥发油提取器中回流提取7 h，获得挥发油。用无水硫酸钠干燥，得到具有刺激性气味的无色透明液体，装于合适的EP 管中密封保存备用。

（2）草豆蔻阴干叶片同理操作，投料比为1.0 ∶12.5（g ∶mL），回流提取时间为6 h，得到具有刺激性气味的浅黄色液体，保存备用。

1.2.2 阳春砂果实、草豆蔻种子团挥发油提取

（1）用粉碎机适当粉碎阳春砂果实，按投料比1.0 ∶12.5（g ∶mL）加入蒸馏水，用挥发油提取器回流提取6 h 得挥发油，用无水硫酸钠干燥，得到具有刺激性气味的黄色或浅黄色液体，装于合适的EP管中密封保存备用。

（2）草豆蔻种子团同理操作，投料比为1.0 ∶6.67（g ∶mL），回流提取6 h，得到具有刺激性气味的黄色或浅黄色液体，保存备用。

1.2.3 挥发油提取率

挥发油提取率按照公式（1）计算。

其中，T为挥发油提取率，m油和m药分别为挥发油质量和药材质量，g。实验重复3 次，计算平均值。

1.3 抑菌实验

1.3.1 制备培养基

称取和量取比例为1 ∶30（g ∶mL）的营养琼脂培养基粉末和无菌蒸馏水，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，用牛皮纸包扎，在高压蒸汽灭菌锅灭菌，倒入培养皿里，约5 mm 的高度，冷却后备用，以上操作均在生物安全柜进行。

1.3.2 制备菌悬液

参考文献[7]制备菌悬液。将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌3 种供试菌分别接种到新鲜斜面培养基上活化，第二天用无菌接种环从斜面培养基上分别挑取各供试菌接种到LB 液体培养基中，于恒温培养箱培养24 h 后吸取200 μL 各供试菌的菌悬液，用无菌蒸馏水分别稀释10、102、103、104、105、106、107、108倍，再分别吸取各供试菌稀释液200 μL 均匀涂到营养琼脂平板上，于恒温培养箱37 ℃倒置培养24 h。每个浓度重复三次，通过平板计数法确定菌液的稀释度，使最后菌悬液含量为106～107/mL，待用。

1.3.3 抑菌圈测定

分别吸取三种菌液200 μL 到上述配制好培养基的平板中，使用涂布器将菌悬液供试菌种涂抹均匀。用灭菌的镊子夹取已灭菌的空白药敏片，浸泡在阳春砂、草豆蔻阴干叶子和果实提取得到的挥发油中，浸泡20 min 之后取出，稍微晾干，贴在已经分别涂布了大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的平板里，每个平板分别贴三片药敏片，分别是阳性对照、空白对照和供试品挥发油，呈正三角形。

大肠杆菌抑菌实验以链霉素（10 μL/片）作为阳性对照，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌抑菌实验以青霉素（10 μL/片）作为阳性对照。空白对照以空白药敏片作为对照。实验重复操作3 次。于电热恒温培养箱（隔水式）37 ℃倒置培养24 h，测量抑菌圈的直径大小，取平均值进行分析。判定标准如表1。

表1 抑菌效果判定标准[8]

2 结果与分析

2.1 挥发油提取率

计算得到阳春砂阴干叶片及果实的挥发油提取率分别为0.40%和2.52%，草豆蔻阴干叶片和种子团挥发油提取效率分别为0.14%和0.73%，两种南药果实均具有较高的含油量。

2.2 阳春砂不同部位挥发油抑菌效果

由表2 可知，阳春砂叶片和果实的挥发油对三种菌株均具有抑菌效果，其中对枯草芽孢杆菌的抑菌效果均强于其余两种菌株，抑菌圈直径分别达到18.67 mm和28.67 mm，为高度敏感；阳春砂果实对金黄色葡萄球菌也有抑菌效果，抑菌圈直径达到26.67 mm，为高度敏感；对大肠杆菌的抑菌效果均较弱。空白对照结果均无抑菌圈。阳春砂叶片和果实对3 种菌株的抑菌效果分别见图1 和图2。

表2 阳春砂不同提取部位挥发油对三种菌株的抑菌效果（±s，n=3） （单位：mm）

表2 阳春砂不同提取部位挥发油对三种菌株的抑菌效果（±s，n=3） （单位：mm）

提取部位大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌供试品 阳性对照 供试品 阳性对照 供试品 阳性对照叶片 8.33±0.47 20.33±0.94 8.00±0.82 37.00±5.72 18.67±1.70 21.33±3.86果实 10.00±0.00 20.00±0.00 26.67±2.36 41.67±2.36 28.67±5.73 35.00±5.72

图1 阳春砂阴干叶片对3 种菌株的抑菌效果

图2 阳春砂果实对3 种菌株的抑菌效果

2.3 草豆蔻不同提取部位挥发油抑菌效果

由表3 可知，草豆蔻叶片和种子团挥发油对枯草芽孢杆菌的抑菌效果最强，抑菌圈直径分别达到21.33 mm 和15.67 mm，为高度敏感；叶片和种子团对金黄色葡萄球菌的抑菌效果相当，抑菌圈直径分别为12.67 mm 和13.33 mm，具有一定的抑菌效果，为中度敏感；对大肠杆菌的抑菌效果均较弱，为偏弱的中度敏感。空白对照均无抑菌圈。草豆蔻阴干叶片和种子对三种菌株的抑菌效果分别见图3 和图4。

表3 草豆蔻不同提取部位挥发油对三种菌株的抑菌效果（±s，n=3） （单位：mm）

表3 草豆蔻不同提取部位挥发油对三种菌株的抑菌效果（±s，n=3） （单位：mm）

提取部位 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌供试品 阳性对照 供试品 阳性对照 供试品 阳性对照叶片 11.33±1.89 22.00±2.16 12.67±0.47 43.00±0.00 21.33±0.94 24.00±0.00果实 9.33±0.82 20.67±0.47 13.33±1.89 44.70±0.94 15.67±1.25 24.33±0.94

图3 草豆蔻阴干叶片对3 种菌株的抑菌效果

图4 草豆蔻种子团对3 种菌株的抑菌效果

3 讨论

多数南药中的挥发油成分具有抗菌作用，如八角茴香挥发油对多种革兰氏阳性菌和阴性菌具有抗菌效果，如金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念球菌等。紫苏叶挥发油对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都有较强的抗菌作用[9]。肉豆蔻挥发油可以抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等，是一种天然的广谱抗菌药。此外，广藿香、丁香、姜黄等南药中挥发油成分也具有此方面的药理作用[10-12]。

阳春砂和草豆蔻是著名的南药，其挥发油含量较高。本研究发现，阳春砂和草豆蔻药用部位（果实/种子团）及非药用部位（叶片）提取的挥发油均对枯草芽孢杆菌表现出较强的抑菌效果，阳春砂果实对金黄色葡萄球菌的抑菌效果较叶片明显，草豆蔻叶片和种子团对金黄色葡萄球菌都有一定的抑菌效果，2 种南药挥发油对大肠杆菌的抑菌效果均不明显。由于挥发油在水中溶解度低，故在培养基中不易扩散，同时挥发油的挥发也降低了其在滤纸表面的浓度，故阳春砂和草豆蔻挥发油的实际抑菌作用可能更强。

有研究表明，阳春砂果实挥发油对金黄色葡萄球菌和粪肠球菌表现出显著的抑制活性[13]。本研究中，阳春砂果实和叶片挥发油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均表现出一定的抑菌效果，其中果实挥发油的抑菌效果更优。研究表明，阳春砂果实挥发油中主要含有乙酸龙脑脂、樟脑和乌药醇，叶片挥发油中主要含有α-蒎烯、β-蒎烯和柠檬烯[14-15]。乙酸龙脑酯作为阳春砂果实的主要药效成分，有显著的抑菌效果，因而果实挥发油抑菌效果更优。阳春砂叶片中的β-蒎烯是植物中广泛分布的挥发性萜类[16]，α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯同样具有抑菌杀菌作用[17-20]。草豆蔻果实及叶片挥发油主要含有法尼醇和桉叶油素[21-22]，其中法尼醇具有杀菌作用[23]。

研究表明，挥发油的整体抑菌活性优于其中若干化学成分的组合，整体抑菌活性与其化学成分之间的协同作用有密切关系[24-26]，微量成分与主要成分更有可能形成协同抑菌作用。基于阳春砂和草豆蔻挥发油中含有的主要化学成分，可认为阳春砂挥发油抑菌活性可能是乙酸龙脑酯、樟脑与其他成分协同作用的结果，草豆蔻挥发油的抑菌活性可能是法尼醇、桉叶油素与其他成分协同作用的结果。

4 结论

本研究表明，阳春砂叶片和果实、草豆蔻叶片和种子团的挥发油对枯草芽孢杆菌均有明显的抑菌效果，对金黄色葡萄球菌表现出一定的抑菌活性。阳春砂果实对金黄色葡萄球菌具有明显的抑菌效果。本研究初步探讨了南药阳春砂和草豆蔻的抑菌活性，为其抑菌活性在食品、药品研究中的开发及应用提供了参考，同时为阳春砂和草豆蔻非药用部位的开发利用提供了理论依据。