补救性卵子激活技术在挽救ICSI未受精卵子中的应用研究

王淑林 翁崇双 巢时斌 郑雯雯

（上饶市妇幼保健院辅助生殖科，江西 上饶 334100）

卵胞浆内单精子显微注射（injection of single sperm，ICSI）是一种通过直接在卵母细胞胞质内注射入精子的辅助受精技术，现目前已在畸精子症、少精子症等病症中得到广泛应用[1]。ICSI受精方式绕过了自然受孕时精子获能、顶体反应及穿过卵子透明带等过程。因此ICSI常被认为是有保障的受精方式，但是临床治疗中仍然有2%～3%患者ICSI受精失败，加上受精率低下的患者也占到ICSI的20%～30%[2]。到目前为止临床上仍没有办法预测和预防ICSI受精失败，由于观察受精时间一般在ICSI后16 h左右，完全不受精或者低受精率的卵子已老化，目前仍然无较好的解决方案改善本次ICSI治疗受精失败后的临床结局[3]。在辅助生殖技术中，激活卵母细胞是受精过程中的关键环节，受精失败和受精率低的主要原因是精子缺乏头部的卵子激活因子，导致卵子激活失败[4]。越来越多的研究以及试验数据表明[5]，对于反复ICSI受精失败的患者，采用ICSI授精方式联合补救性卵子激活（assisted oocyte activation，AOA技术能够显著提高受精率、卵裂率以及胚胎着床率。但目前临床上关于补救性AOA挽救ICSI受精失败卵子中的案例仍罕见报道。基于此背景，本次研究通过观察AOA技术在挽救ICSI受精失败卵子中的应用研究，以更加全面深入的探讨ICSI-AOA是否能够有效改善既往ICSI后受精失败患者临床结局的潜在作用。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2020年11月致2021年11月我院生殖医学中心接受ICSI-AOA治疗的患者58例患者设为试验组，将ICSI助孕失败且仅行常规治疗的58例患者作为对照组（未行AOA处理）；同时将治疗成功的200例患者的新生儿结局作为空白对照组。纳入标准：①本周期获得成熟卵数≥3枚。②符合以下1项标准：前次ICSI周期正常受精率≤30%，前次ICSI周期第3天无优质胚胎，诊断为圆头精子症患者。③距离前次ICSI周期失败间隔＜1年。④患者知情并同意。排除标准如下：①其他类型的严重精子畸形。②卵母细胞本身质量差或畸形。③前次ICSI受精失败的非激活障碍者。因对照组分娩数据样本量偏小，为此选择本院同期接受常规ICSI的200对患者分娩数据进行新生儿结局比较设为对照组。本研究已经通过医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 卵子收集 监测到卵泡发育至少满足下列一个条件时进行扳机：①有3个卵泡直径≥16 mm。②2个主导卵泡直径≥17 mm。③1个主导卵泡直径≥18 mm。扳机后35～38 h后超声引导下经阴道取卵。于5% O2、6% CO2和37 ℃条件下的培养箱（澳大利亚Cook公司）中保持培养2～3 h。去卵冠丘后对裸露卵子进行成熟度评估，对成熟的MII期卵子进行ICSI操作。

1.2.2 ICSI后卵子激活 ICSI注射后，于G-IVF Plus培养基配置的10 μmol/L离子霉素（德国Merck KgAA公司）中进行培养，37 ℃培养10 min。激活后，将卵母细胞经预平衡的受精液漂洗至少3次，继续培养直至受精观察。

1.2.3 原核观察 ICSI后卵子激活16～18 h后显微镜（日本Nikon公司，ECLIPSETi-S、SM2645）下观察评估受精情况，显示不为2个原核（pronucleus，PN）的胚胎为异常受精，只有可见2PN的为正常受精卵。在新配置的培养基中进行正常受精卵培养，3 d后进行卵裂期胚胎发育情况的评估。

1.2.4 胚胎培养及冷冻 在第3天胚胎移植和玻璃化冷冻处理后，将剩余的胚胎转移至囊胚培养基培养5～6 d。采用Gardner评判标准进行囊胚评分[6]，B4-B6囊胚扩张同时有至少一个B的内细胞团和更好等级的囊胚或滋养外胚层用于移植。

1.3 观察指标 ①比较试验组与对照组的总性腺激素剂量、促排时间、子宫内膜厚度、启动性腺激素剂量、扳机日血清孕酮和雌二醇水平等临床特征。②比较试验组和对照组试验结果，包括：获卵数目、注射MII卵子数目、卵裂率、囊胚形成率、完全受精失败率、低受精率、正常受精率、总受精率、D3优质胚胎率、D3可利用胚胎率。评估标准如下。优质胚胎：胚胎中碎片程度≤20%，且卵裂球大小均匀，数目7～9个。可利用胚胎：胚胎中碎片≤20%，且卵裂球数目≥5个[7]。③比较试验组和对照组临床结局，包括取卵和移植周期临床妊娠率、种植率、流产率、取卵和移植周期活产率，胚胎种植率=具有胎心搏动的孕囊数目/同移植胚胎数目×100%；临床妊娠率=临床妊娠患者数/进行胚胎移植患者数×100%。妊娠第4周经阴道超声观察到有胎心的孕囊被确定为临床妊娠；在妊娠20周之前失去临床妊娠被认定为流产；分娩至少1名活产婴儿被确定为活产。④比较试验组和空白对照组新生儿结局，包括新生儿出生体质量、双胎率、早产儿率结局、低出生体质量率、大于胎龄儿率。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0软件分析，定量资料用（）表示，两组间比较采用t检验，计数资料用率（%）表示，行χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 试验组与对照组一般情况比较 两组总性腺激素剂量、促排时间、子宫内膜厚度、启动性腺激素剂量、扳机日血清孕酮和雌二醇水平均差异不显著（P＞0.05）。见表1。

表1 试验组与对照组一般情况比较（）

表1 试验组与对照组一般情况比较（）

2.2 试验组和对照组受精和胚胎发育情况 试验组和对照组在获卵数目、注射MII卵子数目、卵裂率、囊胚形成率比较差异不显著（P＞0.05）；试验组完全受精失败率、低受精率显著低于对照组（χ2=46.561，15.253，P＜0.05）；正常受精率、总受精率、D3优质胚胎率、D3可利用胚胎率显著高于对照组（χ2=339.888，444.509，6.168，7.523，P＜0.05）。见表2。

表2 试验组和对照组受精和胚胎发育情况比较[n=58，，(%)]

表2 试验组和对照组受精和胚胎发育情况比较[n=58，，(%)]

2.3 试验组和对照组临床结局比较 试验组在取卵和移植周期临床妊娠率、种植率、取卵和移植周期活产率均显著高于对照组（χ2=27.228，5.447，5.860，28.554，10.290，P＜0.05）。试验组和对照组流产率比较差异不显著（χ2=2.438，P＞0.05）。见表3。

表3 试验组和对照组临床结局比较[n（%）]

2.4 试验组和空白对照组新生儿结局比较 试验组和空白对照组新生儿出生体质量、双胎率、早产儿率结局、低出生体质量率、大于胎龄儿率比较差异均不显著（χ2=1.114，0.007，0.280，0.038，2.436，P＞0.05）。见表4。

表4 试验组和空白对照组新生儿结局比较

3 讨论

常规体外受精（in vitro fertilization，IVF）受精率为60%～80%，但是仍存在3.5%～20%的受精率低下和完全受精失败的现象[8]。ICSI技术通过将单个精子注入卵胞质内进行受精，有效解决了不孕夫妇中男方及受精障碍等因素导致不育，在治疗男性不育中疗效显著。但ICSI周期中出现完全受精失败的患者仍然还有2%～3%，ICSI后卵子的受精率为70%～80%，成熟卵子中的20%～30%即使注射精子仍无法受精[9]。这多是因为卵母细胞激活失败造成的[10]。注入精子的生物刺激和机械刺激是在ICSI过程中对卵母细胞的主要刺激。当精子进入卵母细胞后会产生一系列的生物反应激活卵母细胞。卵母细胞在针刺进入后会诱发Ca2+波动，但影响并不显著，卵母细胞的酶在完成精子注入后可以修饰精子膜，释放“钙振素”活化卵子，三磷酸肌醇和其他第二信使系统被激活。因此卵母细胞激活失败可能是由ICSI操作过程引发其细胞胞质结构改变导致卵母细胞死亡。有研究表明，磷脂酶C-ζ作为精子赤道板区含有的酶，将其直接注入卵母细胞后，可诱发钙振荡，当精子缺乏磷脂酶C-ζ时会导致受精失败[11]。目前AOA报道中应用包括了钙离子载体激活、化学激活、电激活、注射磷脂酶C-ζcRNA 等方式，其中离子载体在AOA应用效果较好，其作用机制为通过在钙离子载体溶液中暴露卵母细胞，提高卵子胞质中的胞内Ca2+水平，激活下游蛋白级联反应，能够显著提高临床妊娠率[12-13]。

在本研究中，笔者通过建立对照试验观察了因ICSI受精低下或失败再次接受ICSI助孕时进行AOA处理的58例患者，结果显示，试验组和对照组在获卵数目、注射MII卵子数目、卵裂率、囊胚形成率比较差异不显著，试验组完全受精失败率、低受精率显著低于对照组，正常受精率、总受精率、D3优质胚胎率、D3可利用胚胎率、取卵和移植周期临床妊娠率、种植率、取卵和移植周期活产率均显著高于对照组。表明既往ICSI后受精失败患者选择ICSI-AOA技术能够有效提高胚胎发育质量改善其临床结局，有效提高受精率和妊娠率。这一结果与罗阳等[14]和张希等[15]在ICSI-AOA技术中采用离子霉素激活卵母细胞对受精率、胚胎的发育质量影响的试验中所得到的结果相似。结果还表明，试验组和空白对照组新生儿出生体质量、双胎率、早产儿率结局、低出生体质量率、大于胎龄儿率比较差异均不显著。提示ICSI-AOA技术，新生儿结局良好无影响。这与国外的一项关于ICSI-AOA与常规ICSI在双胞胎率、出生体质量等安全性问题的讨论研究结果相同[16]。与Li等[17]在ICSIAOA试验中关于新生儿缺陷类型、出生体质量、分娩时孕周、畸形类型和胎儿性别方面均无显著差异的研究结果相同。

综上所述，既往ICSI后受精失败患者选择ICSIAOA技术能够有效改善其临床结局，有效提高受精率和妊娠率，且新生儿结局良好良好，临床应用价值较高。