血小板源性转化生长因子β1对胃腺癌细胞增殖和迁移的影响

林有东 李 芳 阮海涛

（1 福建省立医院检验科，福建 福州 350001；2 三明市第一医院药剂科，福建 三明 365000；3 福建医科大学医学技术工程学院/福建中医药大学附属人民医院检验科，福建 福州 350004）

胃癌是全球常见的癌症之一，也是位居病死率第三位的癌症[1]。胃腺癌是胃癌中最常见的组织类型，但其潜在的发生发展机制仍尚未阐明[2]。血小板是巨核细胞脱落而来的细胞质碎片，主要在骨髓、血液和肺中生成[3]。血小板与血栓的形成、止血以及机体的免疫和炎性反应包括肿瘤免疫反应密切相关[4-6]。同时也有很多研究发现，血小板通过其颗粒内的生物活性因子促进肿瘤的发生发展。血小板分泌大量的血小板衍生因子，如转化生长因子β（TGFβ）。TGFβ是一种多功能的细胞因子，它代表一个由33个结构相关的细胞外蛋白组成的超家族，它影响了多种生物学功能，如细胞生长、分化、免疫调节和调控各种肿瘤如胃腺癌、肝癌和乳腺癌等的发生发展[7]。因此，目前研究普遍认为TGFβ是治疗多种癌症潜在的重要靶标。TGFβ共有5种亚型，但在哺乳动物如人类体内仅存在TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3，这3种亚型具有相似的作用，其中以TGFβ1最为丰富。人体内的TGFβ主要来源于血小板内的α颗粒。血小板源性的TGFβ1可以通过降低NK细胞介导的细胞毒性的NK组2D（NKG2D）因子及抑制NK细胞的抗肿瘤反应性来降低NK细胞的活性，或者通过降低NK细胞Fas配体和TNF相关的凋亡诱导配体识别和消除肿瘤细胞的作用。血小板源性的TGFβ1也可通过激活TGF-β/Smad和NF-κB通路，诱导上皮细胞间质转化（EMT）促进肿瘤细胞的增殖和转移。也有一些研究认为TGFβ1对肿瘤细胞的作用具有两面性，其参与了肿瘤细胞的免疫逃逸，血小板被肿瘤细胞活化后可能通过纤维蛋白、P-选择素和整合素等分子黏附在肿瘤细胞上形成一层保护物质，使肿瘤细胞避免受到NK细胞的杀伤。体内外试验表明血小板源性的TGFβ1能影响肝癌和卵巢凋亡和转移，但其对胃腺癌细胞生物学行为的影响尚未见报道。因此，本课题探讨血小板源性TGFβ1对胃腺癌细胞增殖和迁移的影响，可以更好地为阐明胃腺癌发生发展的分子机制奠定基础。

1 实验材料与方法

1.1 胃腺癌细胞株 胃腺癌AGS、MKN-45两种细胞株，其中AGS细胞株购买自广州赛诺实验有限公司，MKN-45细胞株为本课题组冻存于福建省立医院检验科细胞室。

1.2 试剂耗材 MKN-45细胞液体培养基DMEM购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；AGS细胞液体培养基F12和PBS缓冲液购自武汉普诺赛生命科技有限公司；胰蛋白酶、青霉素-链霉素混合液和CCK试剂购自北京全式金生物技术有限公司；胎牛血清购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；siRNA（包括NCsiRNA和TGFβR1-homo-351siRNA）由苏州吉玛基因股份有限公司合成；转染试剂购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 将细胞冻存管从液氮罐中取出复苏，于25 cm2细胞培养瓶各加入5 mL培养液后移至37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养。培养瓶内细胞生长状态良好且无污染，贴壁细胞密度已达到80%以上后进行传代分组备用。

1.3.2 实验分组 CCK增殖实验：细胞定量培养于96孔板，每株细胞设未处理组（without treated）、健康人血小板组（normal）、胃腺癌血小板组（cancer）3组。分别是不加血小板、加健康人血小板、加胃腺癌患者血小板进行共培养。划痕实验：细胞定量培养于6孔板。每株细胞设未处理组（without treated）、健康人血小板组（normal）、胃腺癌血小板组（cancer）、胃腺癌血小板+NCsiRNA组（cancer+NCsiRNA）、胃腺癌血小板+TGFβR1siRNA351（cancer+siRNA351）组共5组，分别是不加血小板、加健康人血小板、加胃腺癌患者血小板、加胃腺癌患者血小板和NcSiRNA、胃腺癌血小板和TGFβR1siRNA351进行共培养。

1.3.3 血小板制备 取健康人或者胃腺癌患者静脉血于无菌玻璃管采血管，以800 rpm离心15 min；吸离心后的上清液于无菌玻璃采血管，3 000 rpm离心10 min；弃上清液，得到浓缩血小板团块，之后加入5 mL无菌生理盐水轻轻吹打混匀，再3 000 rpm离心10 min；再次弃上清液，加入5 mL未加小牛血清和双抗的细胞培养液，轻轻吹打混匀备用，显微镜下计数，调整血小板浓度为2×104个/μL。

图1 血小板显微镜镜下计数（400倍）

1.3.4 siRNA转染 细胞定量培养后细胞密度需达到约70%时转染；在进行转染前，需将每孔内的旧培养液弃去，换成新鲜的已配制的培养液2 mL；取无菌离心管，加125 μL未配制的培养液和5 μLsiRNA，用移液枪轻轻吹打混匀，再加入4 μL转染试剂，再次轻轻吹打混匀，避光存放30 min后使用，所得试剂6 h内可用。

1.3.5 CCK细胞增殖实验 ①取对数生长期的肿瘤细胞，制成细胞悬液。进行细胞计数后，96孔板中按照实验分组每孔接种1 0 μL的细胞悬液（每孔2×10³个细胞），再加入140 μL的培养液，每组共8个复孔，放置于37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养12～24 h。②96孔板置显微镜下观察，确认细胞贴壁生长且有足够细胞密度后，根据分组每孔加入浓度为2×104个/μL血小板悬液40 μL、siRNA与细胞共培养12 h。③培养后每孔加入CCK试剂20 μL，轻轻混匀后继续培养，于添加CCK试剂后0、6、18 h用酶标仪测定450 nm的吸光值。

1.3.6 划痕实验 ①取对数生长期的肿瘤细胞，制成细胞悬液。进行细胞计数后，6孔板中每孔各接种300 μL的细胞悬液（每孔5×104个细胞），再加入2 mL配制好的培养液，放置于37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养24 h。②6孔板置显微镜下观察，确认细胞贴壁生长且有足够细胞密度后，弃去培养液，使用10 μL无菌枪头进行划线。③用PBS溶液洗涤划线后的各孔，以使划下的细胞被洗去。洗涤后置于显微镜下观察并拍照记录（0 h）。④根据分组每孔加入浓度为2×104个/μL血小板悬液1 mL、siRNA与细胞共培养；自接种72 h后于显微镜下拍照，使用软件计算划痕面积。

1.4 统计分析 图表绘制使用GraphPad Prism 9.3.1，划痕实验面积计算使用ImageJ软件，结果分析用SPSS 20.0软件，检验水准为双侧P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 CCK细胞增殖实验

2.1.1 AGS细胞增殖实验 AGS细胞在加入CCK试剂并进行温浴后0、6、18 h的OD值见表1，3组的OD值均值分别从0 h的1.107、1.320、0.639快速增长到18 h的4.281、4.805、2.112。在18 h时未处理组OD值（4.281±1.362）与健康人血小板组OD值（4.805±1.393），无统计学差异（P＞0.05）；未处理组OD值（4.281±1.362）高于胃腺癌血小板组OD值（2.112±0.473），有统计学差异（P＜0.05）；健康人血小板组OD值（4.805±1.393）亦明显高于胃腺癌血小板组；OD值（2.112±0.473），有显著统计学差异（P＜0.01）。

表1 AGS细胞CCK增殖实验OD值（）

表1 AGS细胞CCK增殖实验OD值（）

2.1.2 MKN-45细胞增殖实验 MKN-45细胞在加入CCK试剂并温浴后0、6、18 h的OD值见表2。3组的均值分别从0.303、0.397、0.370增长到4.924、4.965、0.988。在18 h时未处理组OD值（4.924±1.102）与健康人血小板组OD值（4.965±1.207）比较变化不大（P＞0.05）；未处理组与健康人血小板组OD值均明显高于胃腺癌血小板组OD值，差异有显著性（P＜0.01）。

表2 MKN-45细胞CCK增殖实验OD值（）

表2 MKN-45细胞CCK增殖实验OD值（）

2.2 划痕实验

2.2.1 AGS细胞划痕实验 AGS细胞划线培养72 h后AGS细胞的各组细胞划痕的面积如图2、图3和表3所示。未处理组划痕面积（2.393±0.370）与健康人血小板组（2.748±0.214）无差别（P＞0.05）；胃腺癌血小板组的划痕几乎被AGS细胞迁移覆盖，其划痕面积（0.799±0.141）均明显小于未处理组、健康人血小板组与胃腺癌血小板加TGFβR1siRNA351组的划痕面积（2.393±0.370、2.748±0.214、2.670±0.387，P＜0.01）；而胃腺癌血小板加TGFβR1siRNA351组的划痕面积（2.670±0.387）明显大于胃腺癌血小板加NCsiRNA组（0.714±0.103，P＜0.01）。

表3 AGS细胞各组划痕面积（）

表3 AGS细胞各组划痕面积（）

图2 AGS细胞各组划痕

图3 AGS细胞各组划痕面积

2.2.2 MKN-45细胞划痕实验 细胞划线培养72 h后MKN-45细胞的各组划痕的面积如图4、图5和表4所示。未处理组划痕面积（5.742±0.288）与健康人血小板组（6.182±0.106）无差别（P＞0.05）；胃腺癌血小板组的划痕大部分被MKN-45迁移，其划痕面积（1.304±0.288）均明显小于未处理组、健康人血小板组与胃腺癌血小板加TGFβR1siRNA351组的划痕面积（5.742±0.288）、（6.182±0.106）、（4.078±0.458），均P＜0.01；而胃腺癌血小板加TGFβR1si-RNA351组的划痕面积（4.078±0.458）明显大于胃腺癌血小板加NCsiRNA组（1.585±0.749），P＜0.01。

表4 MKN-45细胞各组划痕面积（）

表4 MKN-45细胞各组划痕面积（）

图4 MKN-45细胞各组划痕

图5 MKN-45细胞各组划痕面积

3 讨论

胃腺癌目前仍然是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，但控制肿瘤的增殖与转移是尚未解决的一大难题[8-9]。因此，研究胃腺癌细胞增殖与迁移的机制具有重要的价值。本研究为明确血小板源性的TGFβ1是否对胃腺癌细胞的增殖和迁移产生影响，我们选择了AGS和MKN-45两株胃腺癌细胞同时进行体外试验，使用两株细胞提高了实验结果的可靠性[10-12]。

AGS细胞的CCK增殖实验时我们发现，在加入CCK试剂并进行4 h的孵育后，在进行0 h的第1次吸光度测定时，有加入siRNA和转染剂的两组（NCsiRNA与TGFβR1siRNA）所测定的吸光度较接近且均低于未处理组和健康人血小板组。但在同样条件处理下，MKN-45细胞测定的实验结果并没有这种情况，在0 h时，MKN-45细胞的4组实验所测得的吸光度较为接近，因此，我们推测加入的siRNA或转染试剂对AGS细胞具有毒性作用[13]。另外，本研究发现AGS细胞的胃腺癌血小板+NCsiRNA组与胃腺癌血小板+TGFβR1siRNA组之间CCK实验的OD值没有差别，证明血小板源性的TGFβ1对胃腺癌细胞的增殖没有影响。基于以上2个原因，CCK实验只比较了未处理组、健康人血小板组与胃腺癌血小板组的结果。

两株细胞CCK增殖实验结果均表明，未处理组与健康人血小板组两组细胞的增殖差异较小，提示加入健康人血小板不影响胃腺癌细胞的增殖；两株细胞和胃腺癌血小板共培养后，随着培养时间的增加，胃腺癌血小板组的细胞增殖程度明显低于另外两组，结果提示胃腺癌患者的血小板在体外可以抑制胃腺癌细胞的增殖[14]。

AGS细胞和MKN-45细胞的划痕实验结果显示，划线72 h后未处理组与健康人血小板组划痕面积基本相同，汇合度无明显变化，提示健康人血小板对胃腺癌细胞的迁移无明显影响。胃腺癌血小板组划线72 h后划痕内出现大量胃腺癌细胞，划痕面积明显小于未处理组与健康人血小板组，此结果表明胃腺癌患者的血小板在体外可以促进胃腺癌细胞的迁移[15]。

胃腺癌血小板+NCsiRNA组作为利用siRNA进行基因敲减的阴性对照，我们发现胃腺癌血小板+TGFβR1siRNA351组的划痕面积明显增大，进一步证明了胃腺癌细胞的TGFβR1被siRNA351抑制后，胃腺癌细胞的迁移能力较未抑制前明显下降。划痕实验结果证明胃腺癌患者血小板源性的TGFβ1在体外促进了胃腺癌细胞的迁移。

Plantureux等[16]于2020年发表的研究报道通过体内动物实验表明，直肠癌患者的血小板可以抑制结直肠癌细胞的增殖及促进其迁移。我们的实验结果与此报道的结果一致。但由于本实验为体外细胞实验，具有一定的局限性。为进一步探讨血小板对胃腺癌的影响，我们须完善动物体内实验。