miRNA-146通过调控TLR4/NF-κB信号通路促进POI模型卵巢颗粒细胞生长的机制研究*

刘 英,何凤屏,△,刘玉兰,范舒舒,刘彦慧

1.广东省韶关市粤北人民医院体检中心,广东韶关 523125;2.广东省东莞市妇幼保健院/东莞市生殖与遗传研究所,广东东莞 512026

原发性卵巢功能不全(POI)通常是指女性40岁之前闭经,伴有高卵泡刺激素(FSH)和低雌激素水平,卵巢功能丧失导致闭经和性器官萎缩,抑制卵泡生长和发育[1]。目前尚无特异性标志物预测POI的发生,也无有效治疗措施改善卵巢功能,是导致女性不孕的重要原因[1-2]。POI病因不清楚,其发病机制十分复杂,迄今为止尚不明确。文献显示,白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等炎症因子所介导的生理性炎症反应参与卵泡发育、成熟及排卵过程,炎症因子异常表达引发病理性炎症反应,可导致影响卵泡质量和排卵障碍及不孕等事件的发生[3]。卵巢中卵泡的正常发育、成熟及排出是女性孕育的重要条件,从始基卵泡发育至排卵前卵泡的过程中大量相关炎症因子活跃存在,但是任何影响卵母细胞质量及卵泡发育、成熟及排出过程的因素,均可能引起卵泡质量、排卵障碍进而导致女性不孕。据世界卫生组织(WHO)统计,20.0%～40.0%的不孕女性存在排卵障碍和卵泡发育不良,均与慢性炎症有关[4],慢性炎症反应引起的卵泡发育不良和排卵障碍性等常见于POI、多囊卵巢综合征(PCOS)等疾病,长期的慢性炎症还可引起炎症性衰老[5-6],严重影响患者生育力。

微小RNA(miRNA)是一类新的非编码RNA,它通过与靶mRNA特异性结合,降解靶向mRNA或抑制其翻译过程,从而参与疾病的发生和发展,是重要的基因调控分子。既往研究表明,miRNAs在卵巢和生殖细胞中均有表达[7]。miRNA-146是第一个被发现对免疫系统有调节作用的miRNA,miRNA-146可通过负反馈调节核转录因子-κB(NF-κB)信号通路减轻或抑制炎症反应[8]。以往的研究证实miRNA-146通过调控Toll样受体4(TLR4)/NF-κB信号通路抑制脂多糖(LPS)诱导卵巢颗粒细胞凋亡[9]。因此,本研究拟探讨miRNA-146促进卵巢颗粒细胞增殖和生长的作用,分析其是否对TLR4/NF-κB信号通路、TNF-α和IL-6炎症因子有调控作用,为miRNA-146在POI中的作用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1实验动物 健康雌性BALB/c小鼠(8周;体质量18～22 g)40只,购自中山大学动物实验室。小鼠在温度为(22±2)℃、湿度为(50±5)%条件下,光照12 h,黑暗12 h,适应性喂养1周,然后将其随机分为POI组和对照组,每组20只。动物实验获得中山大学动物实验伦理委员会批准(编号:SYSU-IACUC-020-B1236)。

1.2方法

1.2.1小鼠POI模型的建立 参考文献[10]通过注射透明带3肽(pZP3)建立POI小鼠模型,模型建立由中山大学动物室进行并提供POI模型鼠。

1.2.2miRNA-146水平检测 采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miRNA-146水平,采用Trizol法提取血清中总RNA,采用Roche LightCycler 480Ⅱ型荧光定量PCR仪反转录为cDNA,进行PCR扩增反应,内参基因U6,严格按说明书进行操作。miRNA-146、内参U6引物和探针由广州市锐博生物有限公司提供。 miRNA-146a正向引物:5′-CACACAACGTCTCCGCTAT-3′,反向引物:5′-GTGCGATCCAGTCGCG-3′;U6正向引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,U6反向引物:5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反应体系:SYBR Premix Ex Taq 10 μL,正向引物 0.4 μL,反向引物 0.4 μL,ROX Reference Dye 0.4 μL,DNA模板2.0 μL,去离子水6.8 μL。反应条件:95 ℃ 10 s,循环1次;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,循环40次。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1.2.3小鼠卵巢颗粒细胞培养 每只小鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素8～10 U,48 h后,颈椎脱臼处死,无菌条件下迅速取出双侧卵巢,用缓冲液PBS清洗3次,在体视显微镜下去除其周围脂肪和被膜,用1 mL注射器针头刺破卵泡使颗粒细胞和卵母细胞释放出来,加入1 g/L透明质酸酶消化使颗粒细胞与卵母细胞分离,用孔径为0.074 mm筛网过滤,1 000 r/min离心5 min。弃上清液,用PBS(-)清洗3次,加入基础培养液(D/F12培养基+100 U/mL青霉素+100 μg/mL链霉素+0.5μg/mL两性霉素2B+体积分数10%FBS)重悬。倒置相差显微镜观察结果表明,刚接种时颗粒细胞呈球形,10 h后贴壁生长,培养24 h后,形态不规则,呈多角形或梭形。培养5 d时可铺满皿底,形成单层的颗粒细胞。

1.2.4双侧卵巢相对质量测定及组织形态学观察 常规无菌方法留取卵巢,用冰冷生理盐水清洁,滤纸干燥,然后称重,计算小鼠卵巢相对质量[卵巢质量(mg)÷体质量(g)]。

卵巢称重后用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,将蜡块切成4 μm厚的薄片,脱蜡,苏木精-伊红染色。每只切片至少选3个不同区域,高倍镜(×200)下观察卵巢组织结构。

1.2.5卵巢颗粒细胞生长的活力测定 采用MTT比色法测定颗粒细胞生长的活力。miRNA-146转染颗粒细胞接种于密度为1×103个细胞/孔的6孔板中,用磷酸盐缓冲盐水冲洗2次后,10 μL MTT溶液稀释为5 mg/mL,加到每一孔中。将培养皿在37 ℃条件下培养10 min,然后添加150 μL的二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值(A)。

1.2.6卵巢颗粒细胞增殖和凋亡测定 (1)颗粒细胞增殖:采用细胞克隆实验评价颗粒细胞的增殖能力。取对数生长期的细胞,用0.25%的胰蛋白酶消化并吹打为单个细胞,离心后计数,取需要的细胞量(200～500个/孔)重悬于对应的培养基,接种于细胞培养皿里。于37 ℃、5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱内培养2～3周,在显微镜下观察细胞克隆的情况。(2)颗粒细胞凋亡:使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(北京Biosea生物技术有限公司)进行颗粒细胞凋亡检测,鉴定和定量颗粒凋亡细胞。将miRNA转染的细胞接种在密度为1×105个细胞/孔的6孔板中,用冷磷酸盐缓冲盐水洗涤处理细胞2次,并将其重新悬浮在含有10 μL膜联蛋白V和5 μL PI的200 μL结合缓冲液中。将贴壁细胞和漂浮细胞结合,按照说明书进行操作,使用流式细胞仪(美国贝克曼库尔特)测量细胞百分比,以区分凋亡细胞(膜联蛋白V阳性和PI阴性)和坏死细胞(膜联蛋白V阴性和PI阳性)。

1.2.7miRNA-146转染 VSMC消化离心后以合适密度接种到培养板,24 h后细胞融合到60%～70%时按照Lipofec-tamine 2000转染试剂说明书进行操作,分成miRNA-146抑制剂组、miRNA-146模拟物组及对照组,分别转染miRNA-146抑制剂(50 mmol/L)、miRNA-146模拟物(50 mmol/L),对照组加入同等剂量Lipofec-tamine 2000转染试剂及PBS,5 h后换成完全培养基,通过荧光显微镜观察转染效率。通过克隆实验检测miR-146模拟物、抑制物转染后颗粒细胞增殖情况,克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)×100%。

1.2.8蛋白质印迹法及其他实验方法 采用蛋白质印迹法检测小鼠卵巢组织中TLR4和NF-κB蛋白的水平,TLR4和NF-κB抗体购自Abcam公司。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(广州市锐博生物有限公司)检测血清IL-6和TNF-α的水平。采用Cobas 601化学发光仪检测血清FSH和雌激素(E2)水平。

2 结 果

2.1两组小鼠性激素水平比较 POI组的FSH水平高于对照组,而E2水平低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组小鼠性激素水平比较

2.2两组小鼠血清miRNA-146、IL-6、TNF-α水平比较 POI组血清miRNA-146水平低于对照组,IL-6、TNF-α水平高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组小鼠miRNA-146、IL-6、TNF-α水平比较

2.3miRNA-146对卵巢颗粒细胞增殖、活力、生长、凋亡的影响 miRNA-146模拟物增加颗粒细胞的克隆形成,miRNA-146抑制剂抑制颗粒细胞的克隆形成,见图1A。miRNA-146模拟物在颗粒细胞中呈高水平表达,见图1B;在不同水平(5,10,20,40 μg/mL)miRNA-146的作用下,颗粒细胞生长活力均增强,且呈浓度依赖趋势,见图1C。miRNA-146转染后,miRNA-146模拟物组细胞凋亡率低于对照组,miRNA-146抑制剂组细胞凋亡率高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01),见图1D。

注:A为miR-146模拟物、抑制剂转染后颗粒细胞增殖情况;B为miR-146模拟物、抑制物转染后miRNA-146表达水平;C为不同浓度miRNA-146对增加颗粒细胞生长活性的影响;D为各组颗粒细胞凋亡的情况。

2.4两组小鼠卵巢组织中TLR4、NF-κB蛋白的水平比较 miRNA-146模拟物组的TLR4、NF-κB水平低于对照组,而miRNA-146抑制剂组的TLR4、NF-κB水平高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.5相关性分析 Spearman相关性分析结果显示,POI小鼠的miRNA-146水平与TLR4水平和NF-κB水平呈负相关(r=-0.725、-0.681,P<0.05)。

2.6两组小鼠POI模型的卵巢形态学和组织学变化 POI组小鼠的卵巢最大径及质量明显小于对照组(P<0.01)。见表3。POI组小鼠卵巢组织中可见早期卵泡闭锁及退化的卵母细胞和颗粒细胞,伴有大量间质和纤维组织增生,而对照组鼠卵巢组织学可见大量的成熟卵泡。见图2。

注:A为对照组;B为POI组。

表3 两组卵巢最大径及质量比较

3 讨 论

POI可能与炎症反应有显著相关性,而卵巢早衰(POF)为POI发展的终末阶段。慢性低度炎症为POI发生的重要原因之一,UC-MSC移植可通过旁分泌机制发挥抗凋亡和抗炎症反应作用,抑制IL-6 和IL-1β水平,减轻化疗诱导的POI或POF,改善卵巢功能,提示炎症反应的降低可能与POF的改善有相关性,同时也有研究通过临床患者试验证实炎症因子可能作为POI或POF患者的独立生物标志物[11]。根据当前的研究结果笔者推测POF与炎症反应有关。本研究结果显示POI组小鼠的炎症因子TNF-α和IL-6水平高于对照组,主要作用机制可能是miRNA-146负性调控TLR4/NF-κB信号通路,诱导TNF-α和IL-6高水平表达,导致卵巢发生炎症反应、缺氧,影响卵泡质量,最终造成不孕症的发生。POI是一个逐阶递进的过程,在POI的早期,如果调控miRNA-146、TLR4/NF-κB、TNF-α和IL-6水平,可以维持性激素水平在正常范围,不会影响生育能力,提示miRNA-146、TLR4、NF-κB水平与POI模型病情程度密切相关,可发挥临床预警作用。本研究结果显示,POI组血清miRNA-146、E2水平低于对照组,而FSH水平高于对照组,可能是miRNA-146水平下调促进患者雌激素水平的异常,从而影响卵巢功能和卵泡质量[12]。一项在模型体内注射miRNA-146模拟物的研究显示,E2水平显著上调,FSH、LPS水平显著下调[13]。因此,miRNA-146有望作为评估卵泡质量的指标之一。

miRNAs与特异性的靶基因结合,在转录后水平引起靶mRNA剪切和翻译的抑制,参与调控细胞增殖、分化、凋亡、炎症反应、肿瘤的发生等[14],miRNA-146家族成员被称为炎症诱导型miRNAs,参与Toll样受体(TLRs)信号的负反馈调节,诱导炎症反应,参与动脉粥样硬化、心血管疾病的发生和发展有密切关联[15]。TLRs是一种模式识别受体,参与慢性炎症、氧化应激、肿瘤微环境的形成。TLRs识别相应配体后,通过活化一系列信号转导分子激活NF-κB通路,介导炎症反应和氧化应激损伤等免疫反应[8-9]。TLRs存在于卵巢和生殖道中,它们在卵巢和卵泡排卵活动中发挥重要作用。NF-κB、有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)和Janus激酶/信号转导与转录激活子(JAK/STAT)是炎症因子信号转导介导炎症反应的主要通路[16-17],即使作用途径不同,但其中阻碍卵泡发育及排卵过程的相关炎症因子所起的作用是一样的。本研究结果显示,miRNA-146模拟物能够提高颗粒细胞增殖和生长的活力,并减少颗粒细胞的凋亡率,而且miRNA-146水平与颗粒细胞生长呈依赖关系,提示miRNA-146具有促进颗粒细胞增殖和生长的作用。其机制可能是miRNA-146通过调控免疫反应影响HPO轴的神经内分泌活动,诱导雌激素释放,从而促进颗粒细胞增殖和生长。有研究表明,炎症因子IL-6、免疫细胞与NF-κB等信号通路具有相互调控作用,通过影响垂体促性腺激素FSH受体、LH受体表达及卵巢中雌、孕激素的水平以促进卵泡发育,而垂体FSH及LH的合成与分泌受到下丘脑分泌的促性腺激素释放激素(GnRH)的调节,诱导雌激素、孕激素释放,促进卵泡发育和成熟,但其确切机制尚未明确[16-18]。

本研究结果显示,POI组miRNA-146水平低于对照组,miRNA-146模拟物组的TLR4、NF-κB水平低于对照组,而miRNA-146抑制剂组的TLR4、NF-κB表达水平高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05),可能是上调miRNA-146通过调控TLR4/NF-κB信号通路影响TNF-α和IL-6的表达,提示炎症因子TNF-α和IL-6参与卵巢的炎症反应,从而影响卵巢功能的障碍,是一种炎症性的卵巢功能衰竭。本研究结果显示,miRNA-146抑制物诱导小鼠TLR4、NF-κB表达水平显著升高,而miR-146模拟物诱导TLR4和NF-κB表达水平显著降低,提示TLR4可能是miRNA-146的靶基因,并且通过TLR4/NF-κB信号通路对POI发挥调控作用,其机制可能与下游的炎症因子释放有关。

本研究通过HE染色证实了在POI过程中,出现了卵巢体积和质量均减少,原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡等显著降低,闭锁卵泡增加。miRNA-146过表达通过抑制Dab2ip/Ask1/p38MAPK通路和γH2A.X磷酸化减轻小鼠参与卵细胞的增殖与凋亡过程[19],同时有研究表明POF与颗粒细胞凋亡和卵泡早期闭锁密切相关,卵泡颗粒细胞发生凋亡是卵泡早期闭锁的主要原因,这是一个不可逆的逐步损耗过程,卵泡细胞缺乏再生能力,导致女性生殖能力的衰退,在早期闭锁卵泡的颗粒细胞中Bax 促凋亡蛋白大量表达,而在正常或完全闭锁卵泡中几乎不表达;Bcl-2 基因缺失的小鼠模型中,卵泡数量下降,高表达的Bcl-2 基因抑制小鼠卵泡颗粒细胞凋亡和卵泡早期闭锁,表明了在卵泡发育过程中Bcl-2 和Bax基因分别参与卵细胞增殖和凋亡的调控[20],提示miRNA-146是卵巢正常功能的重要调控分子,发挥抑制POI的作用。

综上所述,本研究证明了POI与炎症反应有关,是一种由miRNA调控的卵巢慢性炎症性功能衰退,即miRNA-146可能过TLR4/NF-κB信号通路抑制炎症反应,促进卵巢颗粒细胞增殖和生长,对POI的卵巢功能发挥保护作用。本实验通过相关性分析确定miRNA-146与TLR4/NF-κB信号通路负相关,为miRNA-146在临床的应用提供理论基础。