高效液相色谱法测定鸡血浆中L-肉碱含量

孙雯可，王佳璐，刘鼎阔，李源，于晓雪*，李留安*

（1.天津农学院动物科学与动物医学学院，天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室，天津 300392；2.鼎正新兴生物技术（天津）有限公司，天津市生物饲料添加剂企业重点实验室，天津 300383）

L-肉碱（L-carnitine），又名肉毒碱、左卡尼汀，化学式为C7H15O3N，相对分子质量为162.2，常温下为白色，呈结晶粉末状，在植物中含量少，主要存在于动物肝脏和骨骼肌内[1]。L-肉碱具有多种生理功能：L-肉碱作为转运长链脂肪酸到线粒体内的载体，可通过促进脂肪酸的β-氧化，降低机体内多余的脂肪含量[2-3]；L-肉碱可清除过氧化氢、超氧阴离子，保护内源抗氧化酶系统，起到抗氧化作用[4-5]；外源补充L-肉碱可以减少氨基酸类添加剂和维生素的用量，提高饲料蛋白质的利用率，从而动物体内多余的氨基酸和相关活性离子可用来供给动物体其他生理活动。有研究证明，蛋鸡日粮添加L-肉碱可改善生长期蛋鸡的生产性能，提高产蛋量、鸡蛋蛋品质和种蛋的孵化率[6]；肉鸡日粮添加L-肉碱有助于提髙肉鸡的饲料利用率、降低死亡率[7]。L-肉碱在畜禽养殖、水产养殖中的应用日益广泛，建立准确、快速、高灵敏度检测生物样品中L-肉碱含量的方法，具有重要现实意义。

目前，L-肉碱的检测方法有酶法测定法、分光光度色谱法、毛细管电泳色谱法[8]、液相色谱法等[9]。酶法测定方法易受干扰，影响结果准确性；分光光度色谱法重复性差，不适合大批量样本检测[10]；毛细管电泳色谱法的操作程序复杂性较高[11]。目前，常用高效液相色谱法来检测L-肉碱，但L-肉碱极性强，不易在色谱柱上保留，故本试验采用反向色谱分离技术，通过优化流动相组成和比例，改变流速及样品提取方法，建立一种测定鸡血浆中L-肉碱含量的高效液相色谱法，以期能够快速简便地检测出鸡血浆中的L-肉碱。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 材料与试剂

鸡血浆由华北柴鸡翅下采血，抗凝处理，4 000 r/min离心取上清液获得，-80 ℃冻存；乙腈、甲醇（均为色谱纯）：德国Merck 公司；L-肉碱标准品：北京索莱宝生物科技有限公司；庚烷磺酸钠：上海吉至生化科技有限公司；磷酸（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（1260）：美国安捷伦公司；色谱柱ACE Excel 5 Super C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）：广州菲罗门科学仪器有限公司；超声波清洗机（SB-100D）：昆山市超声仪器有限公司；离心机（H1850R）：长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司；0.22 μm滤膜：天津市南开区青创仪器仪表销售商行。

1.2 反向色谱条件

色谱柱：ACE Excel 5 Super C18型色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-5mmol/L 庚烷磺酸钠（加入0.1%磷酸）水溶液（15∶85，体积比）；流速0.6 mL/min；柱温30 ℃；检测波长210 nm；进样量20 μL。

1.3 试验方法

1.3.1 流动相的选择

考察3 种不同流动相对L-肉碱检测结果的影响：1）乙腈-5 mmol/L 庚烷磺酸钠水溶液=10∶90（体积比）；2）乙腈-5 mmol/L 庚烷磺酸钠（加入0.1%磷酸）水溶液=10∶90（体积比）；3）乙腈-5 mmol/L 庚烷磺酸钠（加入0.1%磷酸）水溶液=15∶85（体积比）。

1.3.2 流速的选择

0.4 mg/mL L-肉碱标准品在流速为0.6 mL/min 和0.7 mL/min 时分别进样，考察流速对L-肉碱分离效果的影响。

1.3.3 样品处理方法

处理方法1：取200 μL 血浆，加入2 mL 乙腈，4 000 r/min 离心，取上清液于5 mL 容量瓶中，用纯水定容，抽取1 mL 溶液经0.22 μm 的有机滤膜注射入进样瓶中，备用。

处理方法2：取200 μL 血浆，加入2 mL 乙腈甲醇混合液（9∶1，体积比），后续步骤同处理方法1。

1.3.4 标准曲线的绘制

取20 mg L-肉碱标准品，用20 mL 纯水溶解，制成1 mg/mL 的标准品储备液。准确吸取不同量标准品储备液分别至于5 mL 容量瓶中，加纯水稀释至刻度并摇匀，分别配制成浓度为0.01、0.05、0.10、0.20、0.40、0.60 mg/mL 的标准品溶液，取20 μL 进样，测定峰面积。以峰面积为纵坐标，标准品溶液浓度（mg/mL）为横坐标，进行线性回归分析。

1.4 数据处理

标准曲线、精密度、回收率和稳定性试验数据由Microsoft Office Excel 软件处理，数据为3 次测定的平均值。

2 结果与分析

2.1 流动相选择

不同流动相对色谱峰的影响如图1 所示。

图1 不同流动相条件试验色谱图Fig.1 Chromatograms of different mobile phase conditions

图1A、B 可知，流动相为乙腈-5 mmol/L 庚烷磺酸钠水溶液=10∶90（体积比）时，0.1 mg/mL L-肉碱标准品保留时间为4.364 min，但在此条件下检测不出样品中L-肉碱；图1C、D 可知，当流动相为乙腈-5 mmol/L庚烷磺酸钠（加入0.1%磷酸）水溶液=10∶90（体积比）时，0.1 mg/mL L-肉碱标准品保留时间为11.278 min，但检测不出样品中L-肉碱；图1E、F 可知，当流动相为乙腈-5 mmol/L 庚烷磺酸钠（加入0.1%磷酸）水溶液=15∶85（体积比）时，0.1 mg/mL L-肉碱标准品保留时间为10.039 min，检测样品中L-肉碱峰形良好；图1G、H可知，在乙腈-5 mmol/L 庚烷磺酸钠（加入0.1%磷酸）水溶液=15∶85（体积比）的流动相条件下，标准品溶剂和样品溶剂在10 min 处均无峰。因此后续试验选择乙腈-5 mmol/L 庚烷磺酸钠（加入0.1%磷酸）水溶液=15∶85（体积比）为流动相。

2.2 流速选择

不同流速对色谱峰的影响如图2 所示。

图2 不同流速对L-肉碱色谱峰的影响Fig.2 Influence of different flow rates on the chromatographic peak of L-carnitine

由图2 可知，在流速为0.6 mL/min 时，L-肉碱保留时间为10.094 min，峰形良好且能与杂峰完全分离；在流速为0.7 mL/min 时，L-肉碱保留时间为8.708 min，峰形不好，拖尾严重，故流速选定为0.6 mL/min。

2.3 不同前处理条件优化

不同前处理条件对色谱图的影响结果见图3。

图3 不同前处理方法提取L-肉碱对色谱峰的影响Fig.3 Effect of L-carnitine extraction by different pretreatment methods on chromatogram

由图2 可知，用处理方法1 提取样品，检测出样品中L-肉碱保留时间为10.075 min，峰面积响应值为2.732 mAU；用处理方法2 提取样品，检测出样品中L-肉碱保留时间为10.118 min，峰面积响应值为4.076 mAU，峰形好，与杂质完全分离。处理方法2 比处理方法1 提取的L-肉碱量高，故本试验采用处理方法2：乙腈甲醇混合液（9∶1，体积比）进行样品处理。

2.4 标准曲线与线性范围

对配制的标准系列溶液进行高效液相色谱法检测，线性试验结果见图4。

图4 标准曲线Fig.4 The diagram of standard curve

由图4 可知，L-肉碱标准曲线方程为y=402.35x-0.228 3（R2=0.999 8），表明L-肉碱在0.01～0.60 mg/mL浓度范围内具有良好线性关系。

2.5 检出限与定量限

L-肉碱的检出限为0.005 mg/mL，定量限为0.017 mg/mL。

2.6 精密度

相同色谱条件下将0.6 mg/mL 的L-肉碱标准品连续进样6 次，检测精密度，结果见表1。

表1 精密度试验结果Table 1 Precision test results

如表1 所示，本方法精密度相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.8%（n=6），精密度良好。

2.7 回收率

将加标浓度为0.01、0.02、0.05 mg/mL 的鸡血浆样品分别进样3 次，结果见表2。

表2 回收率试验结果Table 2 Results of recovery rates

由表2 可知，L-肉碱的平均回收率在97.393%～98.703%，表明该前处理方法具有较高的回收率，能更准确地反映血浆中肉碱的含量。

2.8 稳定性

稳定性结果如表3 所示。

表3 稳定性试验结果Table 3 Results of stability

由表3 可知，该方法稳定性RSD 为0.056%（n=5），表明该方法稳定性良好。

2.9 样品分析

采用上述建立的方法对分离的血浆进行前处理和分析，测得鸡血浆中L-肉碱含量为0.284 mg/mL。

3 讨论

3.1 检测条件的优化

L-肉碱的极性较强，在常规色谱系统中不易保留，但在酸性条件下，L-肉碱可以和离子对试剂反应生成离子对，延长在色谱柱上的保留时间，且在波长为210 nm 时，检测出最大吸收峰[12-13]。本试验在考察流动相的pH 值对L-肉碱出峰时间的影响时，发现在酸性条件下，L-肉碱保留时间更长且检测样品中L-肉碱峰形良好，这与周文清[9]试验结果相似，其研究发现，改变流动相pH 值能够改变物质出峰时间，改善峰形，防止目标峰拖尾。有机试剂洗脱能力强，在色谱系统中，有机相比例增大会缩短物质保留时间。莫紫梅等[14]在检测口服液中L-肉碱含量时发现，L-肉碱的保留时间随着有机相比例增大而缩短，与本研究结果一致，本研究发现当乙腈比例为10%时，L-肉碱标准品保留时间为11.278 min，当乙腈比例为15%时，L-肉碱保留时间为10.039 min，但是在乙腈比例为10%时，检测不出样品中L-肉碱峰，乙腈比例为15%时，样品中L-肉碱峰峰形良好，无杂峰干扰。综合考虑峰形、物质分离度、保留时间等因素，最终选择流动相条件为乙腈-5 mmol/L庚烷磺酸钠（0.1%磷酸）水溶液（15∶85，体积比）。

流速主要影响柱压和出峰时间，提升流速会使出峰时间提前，整体分析时间变短，但柱压也会随之上升，柱压过高则会导致漏液，并且目标峰与杂峰不能很好地分离[15]。本试验考察0.6 mL/min 和0.7 mL/min流速对L-肉碱出峰时间的影响，分析在不同流速进样时，L-肉碱峰形及出峰时间的区别。结果表明，流速变化对分离效果有明显影响，当流速为0.7 mL/min时L-肉碱保留时间为8.708 min，峰形拖尾；流速为0.6 mL/min 时，L-肉碱保留时间为10.094 min，峰形良好。综合考虑峰形、柱压和干扰峰等因素，最终选择流速为0.6 mL/min。

3.2 样品处理条件优化

L-肉碱具有良好的水溶性，易溶于甲醇、乙腈、乙醇等有机试剂[16-17]，且甲醇、乙腈具有沉淀蛋白的作用，可在去除鸡血浆中蛋白质的同时有效提取L-肉碱，但单一试剂提取效果不好[18]，因此本试验比较了纯乙腈和乙腈甲醇（9∶1，体积比）混合液两种前处理方法，分析不同处理对L-肉碱提取量及峰形的影响。结果显示，用纯乙腈提取时，L-肉碱提取浓度为0.146 mg/mL，峰形拖尾且与杂峰距离较近；用乙腈甲醇（9∶1，体积比）混合液提取时，L-肉碱提取浓度为0.284 mg/mL，峰形好，能与杂质完全分离。样品处理时间影响检测样品数量，处理时间越短，检测样品数量越多，可大幅提高工作效率。目前提取血浆中L-肉碱的方法多为衍生化处理，步骤繁琐，分析时间较长。唐笑等[19]在检测罗非鱼血浆中L-肉碱时，经沉淀蛋白质后，用衍生试剂反应90 min；丁峰等[20]、谢根英等[21]在提取病患血液中L-肉碱时，均采用衍生法进行提取，反应时间在1.5 h 左右。本试验处理方法简便且所用时间较短，综合考虑提取量、峰形及分析时间，最终选择样品用乙腈甲醇混合液（9∶1，体积比）进行处理。

4 结论

采用乙腈甲醇混合液（9∶1，体积比）提取鸡血浆中L-肉碱，经过色谱条件优化，确定流动相为乙腈-5 mmol/L 庚烷磺酸钠（0.1%磷酸）水溶液（15∶85，体积比），流速为0.6 mL/min，柱温30 ℃，检测波长210 nm，进样量20 μL 的色谱条件，该方法精密度、回收率、稳定性高，适合于鸡血浆中L-肉碱的检测。