基于低深度全基因组测序技术的拷贝数变异测序辅助诊断胎儿巨细胞病毒感染3 例并文献复习

柴世伟，陈泽俊，刘春桃，陈 甦，何桂林，陈月芬，王瑞霞，朱 薪，凌 奕，顾 硕

（海南医学院第一附属医院胎儿医学科，海南 海口 570102）

出生缺陷是指胎儿出现身体结构、功能或代谢异常，不仅严重危害儿童生存和生活质量，亦对家庭和社会造成严重的经济负担。妊娠相关病原微生物感染是导致出生缺陷的重要原因［1］。巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）是最常见的先天性感染病原体之一，妊娠期感染巨细胞病毒后可经胎盘垂直传播而导致胎儿巨细胞病毒宫内感染，是导致胎儿出生后出现先天性神经性耳聋、视觉异常、智力发育迟缓等出生缺陷的常见原因，严重可引起孕妇流产、死胎、早产和新生儿死亡等情况［2，3］。近年来，巨细胞病毒感染的早期检测和治疗逐步引起产科及产前诊断科医生的高度重视。传统检测技术由于其依赖实验室条件、实验方法缺乏标准化等限制，导致其敏感性和特异性仍存在争议，且传统技术无法区分先天性和产后巨细胞病毒感染［4］。基于下一代测序（NGS）技术的基因组拷贝数变异测序（copy number variant sequencing，CNV-seq）为检测提供了新手段，美国妇产科医师学会（ACOG）已推荐CNV-seq 作为胎儿结构异常时诊断评估的一线检测方法［5］。CNV-seq 利用低深度全基因组测序，可一次性分析23 对染色体非整倍体及100 kb 以上的染色体拷贝数变异［6，7］。本研究回顾性分析海南医学院第一附属医院胎儿医学科900 例超声异常或血清学检测异常患者中3 例CNV-seq 检测巨细胞病毒载量阳性患者的临床基本资料、相关实验室检查、治疗过程及转归，并依据拷贝数给予产前咨询、随访，以期为这类患者的诊疗提供新思路，为CNV-seq 技术在预测胎儿巨细胞病毒感染导致神经系统缺陷等方面的应用提供相关依据，具体如下。

1 病例资料

例1，患者20 岁，G1P0，2020 年05 月15 日于外院行胎儿颈项透明层厚度（nuchal translucency，NT）检查为1.1 mm，2020 年06 月12 日于我院行无创产前DNA 检测（non-invasive Prenatal Testing，NIPT）提示低风险，2020 年09 月03 日我院行胎儿系统超声检查未见明显异常。2020 年09 月28 日孕31+周超声提示“羊水过少”，于我院产前诊断中心抽取羊水样本进行CNV-seq 以检测胎儿染色体及CMV，结果提示检测出CMV 并荧光定量PCR 验证CMV 载量异常。同时该孕妇行CMV 血清学检测提示CMV-IgM 阴性、CMV-IgG 阳性（见表1）。2020 年10 月05 日孕33+周因“胎儿宫内窘迫、胎儿生长受限、羊水过少”经剖宫产娩出1 活女婴。2020年10 月13 日该新生儿行外周血CMV 检测提示CMV-IgM 阳性，尿CMV-DNA 定量 4.54×104Copies/mL（表2），考虑先天性巨细胞病毒感染。2020 年10 月15 日新生儿行心脏超声检查提示卵圆孔未闭，头颅超声检查提示早产儿脑。胎儿头颅MRI 检查未见异常。

表1 孕妇血清CMV 抗体结果Tab 1 Results of CMV antibodies in pregnant women's serum

表2 新生儿尿液CMV-DNA 结果Tab 2 Newborn urine CMV-DNA results

例2，患者21 岁，G3P1，2022 年01 月09 日于外院查NT 为 1.8 mm，2022 年02 月17 日行唐氏综合症筛查结果提示低风险，且胎儿系统超声检查提示未见异常。2022 年04 月01 日血清CMV 检测提示CMV Ig M 阴性、CMV Ig G 阳性（表1）。2022 年04月03 日孕26+周超声提示“胎儿左侧鼻骨未显示、左心室强光点”至我院产前诊断中心抽取羊水样本进行多重短串联重复序列位点分析技术（quantitative fluorescent PCR，QF）、CNV-seq 检测胎儿染色体及CMV。CNV-seq 检测出CMV 并荧光定量PCR 验证CMV 载量异常。2022 年07 月04 日患者孕40 周经阴道顺娩1 活男婴。

例3，患者33 岁，G1P0，2020 年09 月20 日于我院行NT 检查为1.1 mm，2020 年11 月18 日行NIPT提示低风险，2020 年12 月20 日孕25+周行产科超声提示“胎儿心脏比例增大并心脏结构异常、室间隔缺损、主动脉骑跨、肺动脉闭锁”，考虑先天性心脏病复杂畸形，遂至我院产前诊断中心抽取羊水样本进行QF 检测、CNV-seq 检测胎儿染色体及CMV。CNV-seq 检测出CMV 并荧光定量PCR 验证CMV 载量异常。2021 年01 月11 日孕27+周该孕妇进行CMV 血清抗体检测，该结果提示CMV-IgG、CMV-IgM（表1）。该患者于2021 年4 月7 日孕36+3 周因“胎膜早破”经剖宫产术娩出1 活男婴。该新生儿出生后复查CMV 提示CMV-IgG阴 性 ，尿 CMV-DNA 定 量 4.8×104Copies/ml（表2）。

2 结果

2.1 CNV-seq 产前诊断与CMV 检测

3 例孕妇羊水CNV-seq 结果均提示样本中未检出非整倍体或符合性染色体连锁遗传及常染色体显性遗传方式的致病、疑似致病变异（表3）。3 例孕妇均在羊水CNV-seq 的同时对该样本进行CMV 生物信息学分析，通过检出序列数/总序列数比值来明确是否存在CMV。其中病例1 比值为179/2 048 166（0.000 087），病例2 比值为15 619/1 815 815 （0.008 602），病例3 比值为13 227/2 736 964 （0.004 833）（表3）。在此基础上对确定CMV 存在的羊水样本CMV-DNA 进行PCR 定量验证，结果显示3 例羊水样本中均检出CMV，病例1 病毒载量为1 227.76 Copies/mL，病例2 病毒载量为11 639.00 Copies/mL，病例 3 病毒载量为 13 754.60 Copies/mL （表3）。

表3 孕妇羊水CNV-seq 产前诊断与CMV 检测结果Tab 3 Prenatal diagnosis and CMV test results of CNV-seq in amniotic fluid of pregnant women

2.2 妊娠结局及新生儿随访情况

3 例孕妇妊娠期间均未见明显临床症状，且未予抗病毒对症治疗。其中病例1 与病例3 孕妇分别因“胎儿宫内窘迫、胎儿生长受限、羊水过少”和“胎膜早破”经剖宫产术分娩出早产儿，病例2 孕妇足月经阴道顺产。3 名新生儿出生时阿普加评分均满分、外观未见明显异常。结合3 例孕妇或新生儿血清学特异性CMV 抗体、尿液CMV-DNA、CNV-seq定性检测CMV 与PCR 定量验证CMV 的相关实验结果，可考虑临床诊断为妊娠期巨细胞病毒感染或先天性巨细胞病毒感染。同时对新生儿进行长期随访至今未发现生长发育与同龄人有差别，听力检测及其他神经系统检测均未见明显异常（表4），病例3 患儿于 2022 年 01 月、2022 年 05 月因“先天性心脏病复杂畸形”在外院行“体-肺动脉分流术、室间隔缺损修补术Ⅰ期、Ⅱ期分期手术”，术后恢复好，同时其喂养和生长发育较同龄人无差别。

表4 患者妊娠结局及新生儿随访情况Tab 4 Pregnancy outcomes and neonatal follow-up of patients

3 讨论

本研究通过关键词“CNV-seq 和/或CMV”、“高通量测序和/或巨细胞病毒”在PubMed、中国知网、万方等文献平台进行检索，共计获取65 篇CNV-seq 与CMV 的相关文献，但其主要集中于高通量测序技术或CNV-seq 在CMV 基因组图谱分析或CMV 遗传多样性等方面的研究。既往研究通过收集临床已经确诊为CMV 感染患者的不同样本，对不同样本进行CMV 病毒分离，随后对该病毒进行基因组测序以获取病毒基因组图谱进行相关生物信息学分析等。目前暂未发现CNV-seq 或其他高通量测序技术对CMV 进行直接定性或定量检测的研究。然而，本研究则是在CNV-seq 进行常规产前诊断的同时对CMV 进行序列比对定性检测，在此基础上对CNV-seq 检出的CMV 进行PCR 定量验证，并且PCR 与CNV-seq 结果一致。

CMV 感染在人与人之间传播且对于宿主具有明显的物种属别特异性，其感染率因地域文化等因素而呈现差异。CMV 具有嗜神经性，属于最常见的病毒性感染之一，可导致不良妊娠结局及不同程度的出生缺陷［8，9］。由于妊娠各个时期均有感染CMV 的可能，且随着国家二胎、三胎生育计划的不断推进，高危孕产妇的数量逐渐增多，CMV 感染局势不容乐观。然而大多数妊娠期CMV 感染孕妇或先天性CMV 感染新生儿并无明显临床症状，这增加了CMV 感染的诊治难度［10］。

既往研究认为第一次怀孕的女性与2 年内有过生育史的抗体初筛阴性女性在妊娠前3 个月早期原发性CMV 感染及胎儿出生后相关后遗症的风险分别达到了一般人群的19 倍和5 倍［11］。在有临床症状的新生儿中，约25% 会出现远期后遗症；其中65%～80%的存活者可并发严重的神经系统后遗症［12-14］。目前常规CMV 检测方法主要包括ELISA法检测血清特异性IgG/IgM 抗体、Q-PCR 技术定量检测尿液与血液等样本病毒DNA、PP65 抗原检测及影像学检查（如超声、MRI）等。其中血清学特异性抗体常作为CMV 初筛方法，尿液与血液等样本CMV-DNA 为CMV 诊断金标准，影像学结果则作为辅助诊断依据。然而血清学CMV-IgM 阳性率低，CMV-IgG 阳性诊断价值不高，PCR 检测CMV-DNA 对尿液样本具有时间期限，以上检测方法因其各自的局限性均不能避免CMV 感染漏诊情况。本研究中病例1 和病例3 孕妇的血清IgG 为阳性，但是IgM 为阴性；且其新生儿尿液的CMV-DNA 载量均高于弱阳性数值范围下限即2.50×104Copies/mL。尽管患者血清学结果阴性，但是并不能明确是否存在CMV 感染，仍然存在漏诊可能。本研究病例1 和病例3 在结合血液学特异性抗体结果与超声异常结果后对新生儿进一步检查尿液的CMV-DNA，发现存在新生儿先天性CMV 感染。然而本研究病例2 孕妇血清特异性抗体结果与病例1 和病例3 一致，其超声筛查同样提示异常，但由于未对新生儿尿液CMV-DNA 进行检测，因此病例2 无法排除CMV 感染可能。

近年来高通量测序技术迅猛发展，不仅在产前诊断中占据重要地位，同样对于各种临床样本病原体的研究也逐渐增多。其中CNV-seq 作为我国一线产前诊断技术应用于遗传疾病病或基因疾病检测的同时也应用于临床样本中的病原微生物全基因组遗传信息分析等方面。2017 年Hage 等［15］应用NGS 高通量测序技术对从临床CMV 感染的不同样本包括器官移植与先天性CMV 感染儿童的血液、尿液、病变组织等分离CMV 进行CMV 全基因组测序并对富含CMV 靶点的序列分析，揭示了CMV 基因组变化的多样性与抗病毒耐药性的突变特性。与此同时，针对于CMV 全基因组的高通量测序技术也在不断的优化，有研究团队通过对高品质CMV-DNA 制备的研发、NGS 测序流程的优化等过程来助力于CMV 基因谱的完善［14］。尤其在针对先天性CMV 感染患儿尿液中的CMV 高通量测序研究中发现，使用高度敏感的深度测序方法可以有助于了解CMV 基因分型与临床遗传的多样性［16］。然而以上研究重点在于从临床样本中分离CMV 病毒后进行CMV 基因组测序，并未涉及高通量测序技术对样本中CMV-DNA 载量的研究。既往有研究对造血干细胞移植患者外周血进行高通量测序，通过靶向富集方法发现了CMV 感染病毒株谱出现基因变异并且检测出较低载量的CMV-DNA［17］。另一项关于全基因组单核苷酸多态性（SNP）基因分型分析的研究发现多个CNV 区域与HIV-1 病毒载量有相关性［18］。近期，华大公司已开展了高通量测序技术CNV-seq 对病原体检测的生物信息学分析，该技术利用两种宏基因组学工具即Metaphan2 与Kraken 来构建病原体微生物检测的生物信息学流程［19，20］。本研究中3 例病例均采用上述CNV-seq 技术检测CMV，通过对测序数据中检出序列数/总序列数比值分析，结果发现3 例患者的羊水样本中均存在CMV，其比对值分别为179/2 048 166 （0.000 087）、15 619/1 815 815 （0.008 602）、13 227/2 736 964 （0.004 833）。为了证实CNV-seq 对CMV 检测的结果，使用巨细胞病毒核酸检测试剂盒对CMV-DNA 进行核酸定量，结果提示3 例患者CMV病毒载量分别为1 227.76 Copies/mL、11 639.00 Copies/mL、13 754.60 Copies/mL。既往有研究认为羊水巨细胞病毒载量与胎儿预后相关的可能性大，认为CMV-DNA 载量大于103Copies/mL 时，可预测母婴传播的概率，而CMV-DNA 载量大于105Copies/mL，可预测有症状的感染［21］。本研究3例患者及其新生儿随访过程中均未见明显临床表现，与以上研究结果一致。

CNV-seq 技术作为目前应用广泛的产前基因检测技术，不仅可以在诊断CMV 宫内感染或新生儿先天性CMV 感染的同时可以检测胎儿染色体异常或基因异常情况。这对于CMV 感染的产前诊断具有重要的临床意义，不仅可以明确CMV 感染早期诊断以指导临床诊治改善预后，同样可以尽早发现因CMV 感染可能导致的出生缺陷或其他遗传因素等所致的出生缺陷情况。综合上述研究结果认为CNV-seq 可能对CMV 感染的临床诊断具有一定的应用价值，同时可为CMV 感染的一站式产前诊断平台的构建提供相应的临床依据；但后续需继续扩大样本量，同时亦需要在多个产前诊断中心开展前瞻性随机对照研究，为妊娠期巨细胞病毒感染的诊断提供依据，更好地应用于产前诊断领域。