九味化斑丸化学成分及其治疗银屑病的作用机制分析

隋银海，郝 磊，霍志鹏，王 玉，4，何 毅

（1.天津中医药大学，天津 301617；2.天士力控股集团有限公司研究院现代中药开发中心，天津 300410；3.天士力医药集团股份有限公司创新中药关键技术国家重点实验室，天津 300410；4.天津大学 药物科学与技术学院，天津 300072）

银屑病是一种慢性炎症性皮肤病，常年困扰着全球约1%～3%的患者［1，2］。其病理特征为主要分为3 个方面，分别为角质形成细胞异常增殖、炎性细胞浸润和血管增生［3］，临床表现多为红斑、丘疹、鳞屑和瘙痒，影响患者的外貌，且难治易复发，因而需要长期治疗，花费巨大。不仅给患者的身心健康造成很大负面影响，也带来了沉重的经济负担。

九味化斑方是在古代名方“犀角地黄汤”基础上，对处方进行化裁组成的中药复方，君药为黄芩、金银花、水牛角，以凉血散瘀，臣药为赤芍和牡丹皮，既能清热凉血，又能活血，可增化斑之功效，佐药为焦栀子、生石膏和地榆，三者合用以防血与热结，使药为甘草，用以调和诸药。全方共奏清热解毒、活血化瘀和凉血化斑之功效［5］。该方经过多年临床应用，疗效较好，能显著降低寻常型银屑病患者的皮损面积改善其严重程度［6，7］。在前期完成对九味化斑方的有效成分提取、精制、制备九味化斑丸等研究的基础上，本研究利用UPLC-Q-TOF/MSE技术对九味化斑丸中的化学成分进行分析和鉴定，在此基础上采用网络药理学技术，对九味化斑丸中的活性成分进行筛选并对其治疗银屑病可能的作用机制进行预测，以期初步阐明九味化斑丸的药效物质基础，为进一步开展九味化斑丸治疗银屑病的药理研究与临床试验提供参考。

1 材料与方法

1.1 药材与药品

饮片：赤芍（批号：1709133）购自甘肃中天药业有限责任公司，焦栀子（批号：1812015466）、牡丹皮（批号：1812021905）、地榆（批号：2103011264）、甘草（批号：2107021119）购自河北蔺氏盛泰药业有限公司，金银花（批号：220301）、黄芩（批号：220101）购自亳州普润药业有限公司，经天士力研究院中级工程师霍志鹏、郝磊鉴定均符合《中国药典》一部相关规定。

对照品：枸橼酸、没食子酸、木犀草苷、白杨素、汉黄芩素、木犀草素、甘草苷、儿茶素、表儿茶素（中国药品生物制品检定所，批号分别为100396-200301、110831-200803、111720-200905、111701-200501、111514-200403、111520-200504、111610-200604、877-200001、110878-200102），绿原酸、甘草酸铵、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、黄芩素、4，5-O-二咖啡酰基奎宁酸、黄芩苷、芍药苷、芦丁（中国食品药品检定研究院，批号分别为110753-202018、110731-201619、111782-201505、111595-201607、110736-202145、100080-202012、111894-202104、110715-202122），4-咖啡酰基奎宁酸（天津士兰科技有限公司，批号：20150401）。

1.2 仪器与试剂

电子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司），Milli-Q 型超纯水系统（美国Millipore 公司），UPLC-Q-TOF-MS 质谱仪、亮氨酸-脑啡肽（美国Waters 公司），质谱甲酸（梯希爱化成工业发展有限公司），色谱甲醇、质谱乙腈（德国Merck 公司），纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

1.3 数据库与软件

中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），PubChem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），SwissADME 平台（http：//www.swissadme.ch/），SwissTargetPrediction 平台（http：//www.swisstargetprediction.ch/），疾病相关基因与突变位点数据库（DisGeNET，https：//www.disgenet.org/），GeneCards 数据库（https：//www.genecards.org/），DrugBank 数据库（https：//go.drugbank.com/），在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM，https：//www.omim.org/），Therapeutic Target Database（TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/），全球蛋白质资源数据库（UniProt，https：//www.uniprot.org/），Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），STRING 数据库（https：//www.string-db.org/），PyMOL 2.4.0，DAVID 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/），微生信在线作图（http：//www.bioinformatics.com.cn/），Cytoscape 3.9.1，OpenBabel 2.4.1，RCSBPDB 数据库（https：//www.rcsb.org/），AutoDock Vina，Masslynx 4.1。

1.4 基于UPLC-Q-TOF/MSE 的九味化斑丸化学成分分析

1.4.1 九味化斑丸供试品溶液 精密称取2.0 g 九味化斑丸粉末于具塞锥形瓶中，精密加入50 mL 50%甲醇溶液，超声30 min，摇匀，离心10 min（转速：12 000 r/min，半径：9.8 cm），取上清液过0.22 μm 微孔滤膜，即得。

1.4.2 单味药供试品溶液 称取九味化斑丸中各单味药材适量，分别按九味化斑丸中间体制备方法处理得各单味药提取物，精密称取各单味药提取物0.2 g，按1.4.1 项下方法处理，即得。

1.4.3 对照品溶液 精密称定1.1 项下的各对照品适量，用50%甲醇溶解后定容于100 mL 容量瓶中，过0.22 μm 微孔滤膜，即得质量浓度约为80 mg/mL的混合对照品溶液。

1.4.4 检测条件 色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 （2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脱：（0～10 min，5%B；10～55 min，5%～20%B；55～72 min，20%～38%B；72～83 min，38%～90%B；83～85 min，90%B；85～87 min，90%～5%B；87～90 min，5%B）；流速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：3 μL。

质谱条件：采用电喷雾离子源（ESI），在正、负离子模式下扫描，扫描范围m/z50～1 200，毛细管电压2.3 kV，锥孔电压40 V，高纯氩气（Ar）为碰撞气，雾化气体（N2）流速50 L/h，脱溶剂气体（N2）流速800 L/h，脱溶剂气温度350 ℃，离子源温度110 ℃，低能量扫描无碰撞能，高能量MSE模式扫描碰撞能20～50 eV，干燥气温度350 ℃，干燥气流速10 L/min，采用亮氨酸-脑啡肽（m/z554.2615［MH］-，m/z556.2771［M+H］+）实时校正［8］。

1.5 网络药理学分析

1.5.1 活性成分筛选及作用靶点预测 将1.4 项鉴定得到的化学成分进行导入SwissADME 平台进行活性筛选，对符合Lipinski 规则的成分予以纳入，对不满足该条件但属于2020 年版《中国药典》中收录的指标成分，或在TCMSP 数据库中口服生物利用度（OB）≥30，类药性（DL）≥0.18 的成分仍予以纳入。通过PubChem 数据库获得活性成分的Canonical SMILES 并将其导入Swiss Target Prediction 平台进行靶点预测，得到活性成分相关靶点。

1.5.2 九味化斑丸治疗银屑病相关靶点筛选 在GeneCards、DisGeNET、DrugBank、OMIM、TTD 5个数据库中，以“Psoriasis”为关键词收集相关靶点，GeneCards、DisGeNET 分别经“Relevance score”（中位数筛选2 轮）、“Score gda”（≥1）筛选后将5 者收集到的靶点整合去重。将得到的结果与1.5.1 所得药物靶点取交集，从而获取药物- 疾病交集靶点。

1.5.3 核心靶点蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建 将1.5.2 中得到的交集靶点导入STRING数据库，将得到的PPI 网络导入软件Cytoscape 3.9.1 中，经“CytoNCA”计算得到的度值对靶点进行筛选（度值中位数筛选2 轮）得到核心靶点。

1.5.4 GO 分析与KEGG 通路富集分析 利用DAVID 数据库对1.5.3 中得到的核心靶点进行GO 分析和KEGG 分析，选择物种为人，以错误发现率（FDR）≤0.01 为富集标准，并将结果导入微生信在线作图平台进行可视化。

1.5.5 九味化斑丸“成分-靶点-通路”网络构建 将KEGG 分析得到的前20 条通路、对应的靶点和靶点反向对应的活性成分进行整合，利用Cytoscape 3.9.1 构建九味化斑丸“成分-靶点-通路”网络，利用插件“Analyze Network”进行分析、计算，找到度值排名靠前的化学成分，即为九味化斑丸治疗银屑病的关键成分。

1.5.6 分子对接 通过PubChem 数据库下载候选关键成分3D 结构的SDF 文件，在Uniprot 数据库中选择合适的晶体结构，通过RCSBPDB 蛋白数据下载该晶体结构的PDB 格式文件，运用OpenBabel2.4.1、AutoDockTools 1.5.6 软件进行前期处理，利用Autodockvina 运行分子对接并对对接结果打分，通常认为受体与配体的结合能≤-4.25 kcal/mol，表明其有相应的结合能力，≤-5.0 kcal/mol，表明具有较好的结合活性，≤-7.0 kcal/mol 有强烈的结合活性［9-12］。利用PyMOL 2.4.0 软件将分子对接的结果进行可视化。

2 结果

2.1 九味化斑丸的化学成分解析

UPLC-Q-TOF-MS 分析的基峰离子色谱图（BPI 图）见图1，结合九味化斑丸供试品溶液的质谱信息，经对照品比对及参考文献分析，共鉴定出75个化学成分。主要为黄酮和酚酸类成分，具体结果如表1 所示。根据单味药质谱信息将化学成分进行归属分类，其中6 个来源于金银花，23 个来源于黄芩，1 个来源于赤芍，3 个来源于牡丹皮，赤芍与牡丹皮共有成分5 个，17 个来源于地榆，地榆、赤芍、牡丹皮共有成分3 个，4 个来源于焦栀子，17 个来源于地榆，4 个来源于甘草，金银花与焦栀子共有成分8 个，1 个赤芍、牡丹皮、黄芩、金银花、焦栀子共有成分。

表1 九味化斑丸中化学成分的鉴定及归属Tab 1 Identification and attribution of chemical components in Jiuwei Huaban pill

图1 九味化斑丸的 UPLC-Q-TOF/MSE BPI 图Fig 1 BPI chromatograms of Jiuwei Huaban pill by UPLC-Q-TOF/MSE

图2 九味化斑丸靶点与银屑病靶点韦恩图Fig 2 Venn diagram of psoriasistargets and Jiuwei Huaban pill

2.2 网络药理学分析

2.2.1 活性成分筛选及靶点预测 按照2.2.1 中所设筛选条件，从所鉴定的75 个成分中筛选出35 个活性成分，包括黄芩11 个、金银花4 个、焦栀子2 个、地榆5 个、甘草2 个、赤芍与牡丹皮共有成分1 个、金银花与焦栀子共有成分7 个、地榆赤芍和牡丹皮共有成分2 个、黄芩金银花赤芍牡丹皮焦栀子共有成分1 个。预测得到药物靶点388 个。

2.2.2 九味化斑丸治疗银屑病相关靶点筛选 按照2.2.2 项下方法进行靶点收集和筛选，共得到1 274 个与银屑病较为相关的靶点，与2.2.1 中的药物靶点取交集得114 个共有靶点。

2.2.3 核心靶点PPI 网络的构建 按2.2.3 项下方法得到由30 个节点、305 条边构成的核心靶点PPI网络，可视化分析结果见图3。图中节点的越大说明其在整个网络中与其他蛋白作用越强，关系越紧密，提示血管内皮生长因子A （VEGFA）、表皮生长因子受体（EGFR）、肿瘤坏死因子（TNF）、信号转导和转录激活因子3（STAT3）、前列腺素内过氧化物合酶-2（PTGS2）、转录因子AP-1（JUN）等靶点可能在九味化斑丸治疗银屑病中发挥重要作用。

图3 核心靶点PPI 网络图Fig 3 PPI network diagram of core target

2.2.4 GO 功能与KEGG 通路富集分析 GO 功能富集分析得到213 条生物过程（BP），主要与蛋白质磷酸化的正向调节、血管生成、磷脂酰肌醇3-激酶信号传导的正向调节等有关，主要涉及相同的蛋白结合、内肽酶活性、转录因子结合等27 条分子功能（MF），得到40 条细胞组成（CC），提示九味化斑丸的成分主要作用于胞外区、细胞外空间、膜筏等部位发挥作用，分别选取BP、MF、CC 前10 条利用微生信平台进行可视化，见图4A。KEGG 通路富集分析共得到85 个条目，选取前20 条利用微生信平台进行可视化，见图4B。核心靶点主要富集在白细胞介素-17（IL-17）、TNF、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt）、辅助性T 细胞（Th17）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信号通路。

图4 GO 生物功能富集分析（A）及KEGG 通路富集分析（B）Fig 4 GO analysis and KEGG pathway analysis of biological process

2.2.5 成分-靶点-通路网络构建 通过Cytoscape构建的“活性成分-靶点-通路”网络如图5 所示。度值排名靠前的成分木犀草素、黄芩新素Ⅱ、黄芩素、芍药苷、栀子苷等可能为九味化斑丸中起效的关键成分。度值排名靠前的金属基质蛋白酶-2（MMP2）和MMP9 是基质金属蛋白酶家族中最被熟知的2个成员，能水解基底膜中的Ⅳ型胶原从而破坏组织屏障，便于肿瘤细胞的侵袭和转移，另外，MMP9 还可通过释放VEGF 促进血管生成［33］。此外，EGFR、PTGS2、JUN、TNF、胰岛素样生长因子1 受体（IGF1R）等均为较重要的靶点。

图5 九味化斑丸的“活性成分-靶点-通路”网络Fig 5 Network for active components-targets-pathways of Jiuwei Huaban pill

2.2.6 分子对接 选取成分-靶点-通路网络中度值大于中位数（＞4）的活性成分（选择君药黄芩和金银花的指标成分黄芩苷和绿原酸予以补充），与网络中度值前6 的核心靶点EGFR、MMP2、MMP9、PTGS2、JUN、TNF（结合PPI 网络予以补充，分别为VEGFA、STAT3）进行对接，共得到120 组对接结果，结合能均≤-5.9 kcal/mol，其中108 组对接结果结合能≤-7.0 kcal/mol。具体结果见图6。综上，九味化斑丸中筛选出的关键成分与核心靶点的结合较好。部分分子对接结果可视化图如图7所示。

图6 分子对接结果Fig 6 Results of molecular docking

图7 AutoDock Vina 分子对接可视图Fig 7 Results of AutoDock Vina molecular docking

3 讨论

本研究利用UPLC-Q-TOF/MSE技术，共从九味化斑丸中解析出75 个化学成分，多来源于金银花、黄芩和地榆3 味药材，以黄酮、酚酸类为主。经筛选得到35 个潜在活性成分并预测得到30 个核心靶点。网络药理学结果表明，九味化斑丸的主要活性成分木犀草素、黄芩新素Ⅱ、黄芩素、芍药苷、栀子苷等作用于EGFR 、MMP2 、MMP9 、VEGFA 等核心靶点从而调节IL-17、PI3K-Akt、MAPK 等信号通路发挥治疗银屑病的作用

银屑病的病理学特征主要是角质形成细胞增殖、炎症和血管生成［34］。多种活性物质治疗银屑病的报道中，木犀草素可以抑制表皮细胞增殖并促进其凋亡，抑制炎症因子IL-6、TNF-α、IL-17、IL-23 和IL-1β 的表达，缓解银屑病样症状［35-37］。芍药苷可通过核因子κB（NF-κB）通路抑制角质形成细胞（KC）增殖［38，39］，同时降低相关炎症细胞因子（IL-17、INFγ、IL-6、TNF-α）的表达［39］、抗血管生成［40］，从而治疗银屑病。卢传坚等［41］的实验表明栀子苷具有与甲氨蝶呤相当的抗银屑病的作用，但安全性优于后者。作为九味化斑丸君药的指标成分，有文献表明黄芩苷和绿原酸对银屑病有治疗作用，黄芩苷可能通过调控Notch 信号通路、酪氨酸激酶-信号传导及转录激活蛋白（JAK-STAT）信号通路显著抑制角质形成细胞的活性和诱导凋亡［42，43］，同时还能通过抑制γδ T 细胞活化和相关炎性因子（IL-17A、IL-22和IL-23）的产生，从而发挥抗炎的功效［44］。绿原酸抑制皮肤炎症反应来缓解银屑病样小鼠皮损病理改变［45］。本研究分子对接结果也显示，筛选出的活性成分如木犀草素、黄芩素、芍药苷、栀子苷、黄芩苷和绿原酸等与部分核心靶点亲和力较强。推测九味化斑丸主要通过木犀草素、黄芩素、芍药苷、栀子苷、黄芩苷和绿原酸等化学成分发挥治疗银屑病的作用。

EGFR 是一种酪氨酸激酶，与MAPK 通路、PI3K-Akt 通路、JAK/STAT 通路的调节有关［46］。在银屑病中，高水平的EGFR 可导致KC 过度增殖和异常分化，同时还能上调Decoy Receptor 3（诱骗受体 3）从而促进炎症反应和血管生成［47］。VEGF可由KC 细胞分泌，VEGFA 是VEGF 家族中的一员，可促进新生血管生成和使血管通透性增加，参与银屑病的发病过程［48］。在银屑病患者的皮肤中可以发现高水平活化的STAT3［49］，STAT3 可介导Th17 细胞分泌IL-17、IL-22 等炎性因子，还可直接激活IL-17A 和IL-17F 产生炎症反应，IL-17A 及其它多种炎性因子可导致KC 的增殖［50］。

九味化斑丸治疗银屑病的KEGG 通路富集分析效用机制主要有IL-17、TNF、PI3K-Akt、Th17、MAPK 等信号通路。MAPK 通路由P38 丝裂原活化蛋白激酶 （P38 MAPK）、细胞外信号调节激酶1/2 （ERK1/2）、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）、ERK5 四条亚通路组成［51］。P38 MAPK 和JNK 分别诱导Th1 和Th2 的分化，从而共同介导KC 细胞增殖，P38 MAPK 和ERK 可调控血管生成，P38 MAPK、ERK1/2、JNK 可调节下游的炎症因子，从而加重银屑病的炎症反应［52］。PI3K/AKT 信号转导通路是细胞存活的重要通路，参与细胞生长、增殖、能量代谢等多个过程，另外也参与血管新生［53］。PI3K-Akt信号通路能够通过磷酸化和诱导叉头转录因子（FOXO）下调来影响角质形成细胞的增殖，可能是治疗银屑病的潜在靶点［54］。IL-17 通路、Th17 通路和TNF 通路在银屑病病程中发挥重要作用，成熟的Th17 细胞分泌IL-23 和IL-17，IL-23 能够反过来促进Th17 细胞的分化、成熟，IL-17 与相应受体结合后可激活P38 MAPK，同时，IL-17 能够通过上调IL-8 导致银屑病皮损处表皮过度角化［55］，此外，IL-17与TNF-α 可协同诱导KC 细胞产生多种炎性介质，阻断TNF-α 可下调IL-23，从而抑制Th17 介导的免疫反应［56］。

综上所述，本研究利用UPLC-Q-TOF-MSE技术结合网络药理学研究，推测九味化斑丸治疗银屑病的有效成分主要为黄芩素、木犀草素、栀子苷、芍药苷、黄芩苷、绿原酸等化学成分，通过作用于EGFR、MMP2、MMP9、VEGFA、TNF、STAT3 等靶点调节IL-17、TNF、PI3K-Akt、Th17、MAPK 等信号通路发挥抑制炎性因子释放、抑制角质细胞过度增殖、抑制皮损组织血管新生等作用。本研究初步明确了九味化斑丸治疗银屑病的药效物质基础，为其质量标准研究提供依据，也为后续结合体外实验的作用机制深度研究提供思路与参考。

作者贡献度说明：

隋银海：设计并执行研究方案，采集与分析数据，撰写论文，最终版本修订；郝磊：提出研究思路，指导论文的撰写与修订；霍志鹏：指导实验操作，参与论文修订；王玉、何毅：所有实验试剂资金支持和技术指导。

所有作者声明不存在利益冲突关系。