Design-Expert软件设计优化万寿菊黄酮提取工艺及抗氧化活性、抑菌活性测定

2023-08-08 01:06韩秀枝曹源詹跃勇秦令祥
食品研究与开发 2023年14期
关键词:万寿菊负压黄酮

韩秀枝,曹源,詹跃勇,2,秦令祥,2,3*

(1.漯河食品职业学院,河南 漯河 462300;2.漯河市食品研究院有限公司,河南 漯河 462300;3.河南和生食品有限公司,河南 漯河 462300)

万寿菊(Tagetes erecta L.),又名金盏花、臭芙蓉等,是一年生草本植物,属被子植物门、双子叶植物纲、菊目、菊科、万寿菊属,原产于墨西哥及中美洲,在我国各地均有种植。万寿菊中含有多糖、黄酮、挥发油、氨基酸、生物碱、萜类等多种功能成分[1-6],具有提高免疫力[7]、抗癌[8]、抗氧化[9]、抗炎[10]、抑菌[11]、降血脂[12]和抗动脉粥样硬化[13]等功效。万寿菊黄酮(Tagetes erecta L.flavonoids,TEF)是万寿菊中主要的生物活性成分之一,具有较高食用和保健价值,其花中含有的黄酮较多。

目前,常用的黄酮提取方法有热回流法、溶剂法、微波法、超声波法等[14],这些方法各有利弊。郭耀东等[5]在常压条件下采用超声辅助提取TEF,得到了最佳工艺条件;上述方法大都需要高温或高压或常压,容易导致黄酮被破坏[15-16]。负压技术利用原料在真空负压下产生强烈的空化和机械效应,使其细胞壁在较低温度下破碎,其活性成分不易降解,最大限度地保留其生物活性。超声法一般是在常压下进行,其提取温度通常较高,容易使黄酮结构发生降解和活性降低。为了弥补常压法和黄酮在高温下会降解的不足,本文拟采用负压协同超声波辅助提取TEF,利用Design-Expert 软件设计优化提取条件,通过数学模型获得最佳条件,同时研究其抗氧化活性和抑菌活性,为TEF 的提取、应用和产业化提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

万寿菊:亳州中药材市场;芦丁标准品(≥98%):北京谱析标准技术有限公司;硫酸亚铁、无水乙醇、氢氧化钠、三氯甲烷、硝酸铝、亚硝酸钠、水杨酸、过氧化氢、四氯化碳、正丁醇、联苯双酯、维生素C(均为分析纯):南京化学试剂股份有限公司;1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-diphenyl-2-bitter hydrazine,DPPH)试剂:武汉卡诺斯科技有限公司。

1.2 仪器与设备

超声波清洗器(KM-300DE):昆山美美超声仪器有限公司;无油真空泵(VP-1800V):东莞市盛飞真空设备有限公司;台式高速离心机(TD6M):绍兴市苏珀仪器有限公司;旋转蒸发仪(RE500):上海远怀实业有限公司;紫外可见分光光度计(N6000S):青岛精诚仪器仪表有限公司;手提式高速万能粉碎机(DFT-50):上海化科实验器材有限公司;台式真空干燥箱(DZF-6020):中新医疗仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 万寿菊预处理

将万寿菊清洗干净,置于低温烘箱烘干,再用粉碎机粉碎,过0.18 mm 筛,备用。

1.3.2 TEF 的提取流程

万寿菊粉→按料液比1∶20(g/mL)加入70%乙醇溶液→放入超声波清洗器中,按照负压协同超声波辅助法的条件提取→离心(5 000 r/min,15 min)→浓缩→纯化[17](AB-8 型大孔树脂)→浓缩→真空干燥→制得TEF。

1.3.3 TEF 得率测定

参照符群等[18]的方法,以芦丁为标准品,采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 显色法测定。TEF 得率(A,%)的计算公式如下。

式中:C 为提取液的质量浓度,mg/mL;V 为提取液的体积,mL;M 为万寿菊样品质量,mg。

1.3.4 TEF 提取单因素试验

以TEF 得率为指标,固定乙醇浓度70%、料液比1∶20(mg/mL)、提取温度50 ℃、负压0.08 MPa、超声波功率400 W、超声时间30 min。分别考察不同负压(0.05、0.06、0.07、0.08、0.09 MPa)、超声功率(250、300、350、400、450 W)、超声时间(10、20、30、40、50 min)对TEF 得率的影响,每组试验重复3 次。

1.3.5 响应面优化试验

在单因素试验的基础上,以TEF 得率为响应值,利用Design-Expert 12 软件进行响应面试验设计。试验因素与水平见表1。

表1 试验因素与水平Table 1 Test factors and levels

1.3.6 抗氧化活性的测定

1.3.6.1 DPPH 自由基清除能力测定

根据吴杨洋等[19]的方法进行测定。

1.3.6.2 羟基自由基清除能力测定

根据王迦琦等[20]的方法进行测定。

1.3.7 抑菌活性的测定

根据李晓娇等[21]的方法,利用2 倍稀释法,将TEF用无菌水配成系列梯度浓度的样品液,备用。采用龚祥等[22]的滤纸片法,将圆形滤纸片灭菌后,放在含供试菌的培养皿上,用移液管移取5 μL TEF 样品液滴在滤纸片上,置于生化培养箱中,35 ℃培养24 h,测其抑菌圈直径,加无菌水的滤纸片作对照,最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)为开始出现抑菌圈时的浓度。

1.3.8 数据处理

各试验均重复3 次取平均值。采用SPSS 软件和Design-Expert 12 软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 负压对TEF 得率的影响

负压对TEF 得率的影响见图1。

图1 负压对TEF 得率的影响Fig.1 The effect of negative pressure on TEF yield

由图1 可知,随着负压的升高,TEF 得率先升高后下降,在负压为0.08 MPa 时,达到最大值。这是由于负压升高,负压作用于料液产生的空化气泡增多,其空化效应和机械振动作用增强,导致万寿菊细胞壁破裂速度、程度和数量增加,胞内黄酮扩散、溶解增多,得率升高;当负压为0.08 MPa 时,由负压导致的细胞破裂基本完全,黄酮溶出基本彻底,再继续升高负压,提取温度会下降,黄酮的扩散、溶出减小,得率略有下降。因此,负压取0.08 MPa 为宜。

2.1.2 超声功率对TEF 得率的影响

超声功率对TEF 得率的影响见图2。

图2 超声功率对TEF 得率的影响Fig.2 The effect of ultrasonic power on TEF yield

由图2 可知,随着超声功率的增大,TEF 得率先升高后略有降低,在400 W 时达到最高。这是因为超声功率增大,其空化、机械效应增强,万寿菊细胞的破裂程度、数量增大,得率提高;当超声功率400 W 时,细胞破裂基本完全,黄酮基本溶出完全,再继续增大超声功率,黄酮溶出也不再增加,反而过高的超声功率会破坏部分黄酮结构,降低其得率。因此,超声功率取400 W 为宜。

2.1.3 超声时间对TEF 得率的影响

超声时间对TEF 得率的影响见图3。

图3 超声时间对TEF 得率的影响Fig.3 The effect of ultrasonic time on TEF yield

由图3 可知,随着超声时间的延长,TEF 得率呈先升高后下降的趋势,并在30 min 时达到最大。这是因为超声时间延长,超声波的空化和机械作用增强,万寿菊细胞壁破裂程度和数量增大,黄酮溶出增多,得率提高;当时间超过30 min 后,过长的超声时间,会使部分黄酮结构破坏,得率下降。因此,超声时间取30 min为宜。

2.2 响应面试验结果

2.2.1 回归方程的建立

在单因素的基础上,以负压(A)、超声功率(B)和超声时间(C)为3 个影响因素,TEF 得率(Y)为响应值,试验方案与结果见表2。

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Response surface test design and results

采用Design-Expert 12 软件,对表2 的试验数据进行回归拟合,得到回归方程Y=5.16+0.352 5A+0.053 8B+0.108 8C+0.042 5AB-0.032 5AC-0.030 0BC-0.730 0A2-0.852 5B2-0.757 5C2。

2.2.2 回归模型的方差分析

对上述回归模型进行方差分析,结果见表3。

表3 回归模型方差分析结果Table 3 Results of variance analysis of regression model

由表3 可知,该回归模型的P<0.01,表明模型极显著;失拟项P=0.151 5>0.05,不显著,拟合度较好,说明该模型可信度高;另外,模型的决定系数R2=0.999 7,说明模型拟合程度良好。R2Adj=0.999 2,说明该模型能解释99.92%响应值的变化,自变量和响应值间线性关系显著。综上所述,该模型可用于TEF 的提取工艺优化。从显著性结果可知,A、B、C、AB、A2、B2和C2项影响极显著(P<0.01),AC、BC 影响显著(P<0.05)。根据F 值大小可知,各因素影响顺序为A>C>B。

2.2.3 响应面分析

利用Desgin-Expert 12 软件绘制的各因素交互作用的响应面和等高线见图4。

图4 各因素交互作用的响应面与等高线Fig.4 Response surface and contour map of interaction of various factors

由图4 可知,AC 和BC 响应面较弯曲,等高线呈椭圆形,说明AC 和BC 之间的交互作用显著(P<0.05),AB 的响应曲面更陡峭,曲面更弯曲,说明该交互作用极显著(P<0.01),这与方差分析结果一致。

2.2.4 最佳条件的预测及验证试验

通过模型的建立,预测最佳工艺条件为负压0.082 MPa、超声功率401.81 W、超声时间30.66 min,理论TEF 得率为5.21%。考虑到实际操作,对最佳工艺条件修正为负压0.08 MPa、超声功率402 W、超声时间30 min,对此条件下建立的模型进行验证试验,重复3 次,得到实际TEF 得率平均值为5.18%,与预测值相对误差0.58%,表明该模型可靠。

2.3 抗氧化活性测定结果

2.3.1 DPPH 自由基清除能力

不同浓度的TEF 对DPPH 自由基的清除能力见图5。

图5 不同浓度的TEF 对DPPH 自由基的清除能力Fig.5 The scavenging ability of different concentrations of TEF on DPPH free radicals

由图5 可知,随着TEF 和VC质量浓度的增大,其清除DPPH 自由基的能力均不断增强。当TEF 浓度为250 μg/mL 时,清除率为81.73%,弱于同浓度的VC,说明其在适宜的浓度下,有较强的清除DPPH 自由基能力。

2.3.2 羟基自由基清除能力

不同浓度的TEF 对羟基自由基的清除活性见图6。

图6 不同浓度的TEF 对羟基自由基的清除活性Fig.6 The scavenging activity of different concentrations of TEF on hydroxyl radicals

由图6 可知,随着TEF 和VC质量浓度的增大,其羟基自由基清除能力逐渐增强,并呈正相关,当TEF浓度为250 μg/mL 时,羟基自由基清除率为83.28%,比同浓度的VC略低,表明其在适宜的浓度下,具有较强的羟基自由基清除能力。

2.4 抑菌活性测定结果

不同质量浓度TEF 抑菌活性结果见表4。

表4 不同质量浓度TEF 抑菌活性结果Table 4 The bacteriostatic activity results of TEF with different mass concentrations

由表4 可知,TEF 在一定质量浓度下,对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有一定的抑菌作用,而对照组无抑菌圈出现。TEF 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)分别为1.0 mg/mL 和1.5 mg/mL,且抑菌效果随着TEF 质量浓度的增加不断增强。

3 结论

本试验采用负压协同超声波辅助提取TEF,并经响应面优化提取工艺,得到最佳提取工艺条件为负压0.08 MPa、超声功率402 W、超声时间30 min,在此条件下,TEF 得率为5.18%。TEF 抗氧化活性研究表明,随着TEF 浓度的增加,其对DPPH 自由基和羟基自由基的清除能力逐渐增强,当其浓度为250 μg/mL 时,清除率分别为81.73%和83.28%,表明TEF 抗氧化能力较强,是一种理想的天然抗氧化剂。TEF 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有一定的抑菌作用,最低抑菌浓度分别为1.0 mg/mL 和1.5 mg/mL,且随着TEF 浓度的增加而不断增强。本试验可为TEF 的提取及应用提供理论依据。

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