不同采摘时期桃金娘叶三萜的动态变化研究

◎ 赵 武，覃思明，银慧慧，颜国庆，曾雪颜，刘 伟

（1.广西壮族自治区兽医研究所，广西兽医生物技术重点实验室，农业农村部中国（广西）-东盟跨境动物疫病防控重点实验室，广西 南宁 530001；2.南宁市隆安县古潭乡水产畜牧兽医站，广西 南宁 532708）

三萜类化合物（Triterpenoids）是一类由异戊二烯单元为基础组成的天然产物，其特征是以多种方式修饰的基本骨架形成的天然三萜类化合物，呈现结构的多样性和高度的多功能性[1]。常见的三萜类有机化合物为四环三萜和五环三萜，其中五环三萜化合物是由5个碳原子组成的环和3个相邻的异构烷基侧链构成，呈现广泛的药理作用，具有多种生物学活性[2-3]。目前已从天然植物中发现并提取到多种五环三萜类化合物，如熊果酸、齐墩果酸、白桦酯酸、白桦脂醇和羽扇豆醇等，经研究发现其具有显著的抗肿瘤、抗病毒、抗炎和免疫调节等特性[4-5]。

桃金娘是一种潜在的药用植物，该植物的叶、根、芽和果实均可药用。目前已发现桃金娘叶提取物在收敛止泻、止血方面具有一定作用功效，不仅能促进伤口愈合，还常用于治疗急性胃肠炎、腹泻、消化不良、痢疾及呕吐等消化道疾病[6-7]。此外，桃金娘叶提取物对细胞和内孢子具有显著的活性，可作为一种替代的食品添加剂控制蜡样芽孢杆菌[8]。目前已在桃金娘叶中发现多种三萜类化合物，其具有较好的抗氧化性[9-11]。本研究以桃金娘叶为研究对象，采摘不同时期的桃金娘叶经干燥处理后提取，探讨不同采摘时期桃金娘叶三萜含量的动态变化，为开发桃金娘作为功能性食品提供理论参考依据和新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桃金娘叶，产地为广西玉林（东经109°39′至110°18′，北纬22°19′至23°01′），采摘时间分别为2019年的3月27日、4月22日、5月14日、6月20日、7月24日、8月20日和9月22日，经广西壮族自治区兽医研究所兽药新技术研究开发中心刘伟正高级兽医师鉴定为桃金娘植物叶。将不同采摘时期的桃金娘叶置于65 ℃烘箱中烘干至恒重，粉碎后过40目筛，备用。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、L-抗坏血酸（维生素C），美国Sigma-Aldrich公司；熊果酸对照品，中国食品药品检定研究所；乙酸乙酯、冰醋酸、甲醇、高氯酸和香草醛（均为分析纯），成都科隆化学品有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

TECAN model Infinite M200酶标仪，瑞士帝肯公司；HH-S4型恒温水浴锅，江苏金怡仪器科技有限公司；SK7200HP型超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；Milli-Q超纯水仪，密理博中国有限公司；F160型粉碎机，北京中兴伟业仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 桃金娘叶三萜提取

准确称取过筛后的桃金娘叶细粉1.0 g，置于100 mL具塞锥形瓶内，吸取乙酸乙酯溶液50 mL与桃金娘叶细粉轻轻摇匀混合，称定得到的悬浮液锥形瓶重量，在功率294 W、频率53 kHz、温度30 ℃的条件下超声提取90 min，超声结束后室温放冷，用乙酸乙酯补足重量，离心过滤，收集上清液置于50 mL棕色容量瓶中，并用乙酸乙酯溶液定容至刻度，充分摇匀后得到样品待测液[11]。

1.3.2 标准曲线制备

不同采摘时期桃金娘叶三萜含量的变化采用香草醛-高氯酸显色法进行测定[12]。精密称取熊果酸对照品5.3 mg，加入少量甲醇溶液轻摇至溶解，用甲醇定容至50 mL，制成浓度为106.0 μg·mL-1的熊果酸对照品溶液备用。分别精密移取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL和1.2 mL的熊果酸对照品溶液，置于容量为10 mL的具塞试管中，在80 ℃下水浴，待试管中溶液蒸干后，按照顺序依次加入0.2 mL浓度为5%的香草醛冰乙酸溶液和0.8 mL高氯酸溶液，迅速摇匀，将试管置于温度为70 ℃的水浴锅中，水浴处理样品15 min后放冷至室温，吸取冰醋酸溶液5 mL于锥形瓶内混合摇匀，制成熊果酸浓度分别为0 μg·mL-1、3.53 μg·mL-1、7.07 μg·mL-1、10.60 μg·mL-1、14.13 μg·mL-1、17.67 μg·mL-1和21.20 μg·mL-1的系列对照品溶液。分别精密吸取系列对照品溶液200 μL于96孔板中，设置酶标仪波长参数为545 nm，测定96孔板中样品的吸光度。

1.3.3 桃金娘叶三萜含量测定

将1.3.1提取到的样品待测液按1.3.2标准曲线的制作步骤顺序进行处理，一式三份，酶标仪波长参数设置为545 nm，在此波长下对桃金娘叶样品待测溶液的吸光度进行测定，并根据1.3.2测定得到的标准曲线回归方程计算样品待测液浓度。桃金娘叶三萜含量计算公式为

其中：W为桃金娘叶待测样品中三萜含量，mg·g-1；C为根据标准曲线计算得到的桃金娘叶提取样品溶液的三萜浓度，μg·mL-1；V为桃金娘叶样品提取液体积，mL；m为准确称取的桃金娘叶粉末质量，g。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

标准曲线的建立是以熊果酸对照品溶液的浓度C（μg·mL-1）为横坐标（X轴），对应浓度的对照品溶液吸光度值A为纵坐标（Y轴），绘制的标准曲线见图1。回归方程为A=0.016 1C+0.053 9，R2=0.990 7，熊果酸浓度在0～21.20 μg·mL-1呈良好线性关系，可用于桃金娘叶中三萜含量的测定。

图1 标准曲线图

2.2 不同采摘时期桃金娘叶三萜含量变化

取2019年3月27日、4月22日、5月14日、6月20日、7月24日、8月20日、9月22日采摘的桃金娘叶样品7份，测定桃金娘叶三萜含量，结果见图2。3—6月采摘的桃金娘叶中三萜含量呈上升趋势，6月以后采摘的桃金娘叶三萜含量逐渐下降，其中5月14日至7月24日采摘的桃金娘叶三萜含量较高，6月20日采摘的桃金娘叶中三萜含量最高，为22.54 mg·g-1。

图2 2019年不同采摘时期桃金娘叶三萜含量变化规律图

3 讨论

桃金娘叶中含有大量三萜类化合物，在不同的采摘时期桃金娘叶三萜的含量不同。研究结果显示，5月14日至7月24日采摘的桃金娘叶中三萜类物质含量相对较高。因此，为了从桃金娘叶中获得更多的三萜类物质，适宜在6月左右对其进行采摘。桃金娘为桃金娘科桃金娘属灌木植物，喜高温、高湿的环境，花期为4—5月，果实成熟在8—10月。桃金娘叶中三萜类物质在其花期开始呈现上升趋势，在果实成熟期呈现下降趋势，可能是随着季节变化，光照、气候改变，桃金娘叶中活性成分也会发生改变。桃金娘的生长旺季是在春、夏、秋3个季节，冬季生长缓慢。春季到夏季是桃金娘生长旺盛的时期，此时三萜类化合物顺势蓄积，到盛夏时节气温升高，三萜类化合物含量达到最高，秋季温度开始降低、气候干燥，三萜类化合物的蓄积能力逐渐减弱。

桃金娘具有药用价值，其富含有多种植物化学成分，包括萜类、酚类和脂类等，该植物已被用于治疗腹泻和伤口愈合等。目前，已从桃金娘的叶、根和果实中鉴定出大量酚类和萜类化合物，并证明了其在抗氧化、抗菌、抗炎和抗肿瘤等方面的生物活性，有研究显示，桃金娘叶提取物能作为天然抗葡萄球菌添加剂应用到食品中[13]。还有研究显示，桃金娘叶的甲醇提取物可作为抗氧化剂和抗糖尿病药物的潜在来源[14]。

三萜类化合物广泛存在于植物界。目前从桃金娘叶片中已鉴定出多种三萜类化合物，已分离出24个三萜类化合物，包括齐墩果酸、β-香树酯醇，α-香树酯醇、羽扇豆醇、白桦脂醇、β-香树脂酮醇和肉毒素等[15-17]。齐墩果酸是一种α-羟基酸，具有护肝降酶、促进肝细胞再生、抗氧化、抗炎、抗肿瘤以及增强免疫力的作用[18]；白桦脂醇是一种天然的植物次生代谢产物，有研究显示，将白桦脂醇作用于多种肿瘤细胞时，发现均有明显的抑制作用[19]，此外，还发现白桦脂醇具有抗人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）、抗乙肝病毒（Hepatitis B Virus，HBV）、抗炎和免疫调节等多种药理作用[20]；羽扇豆醇是一种活跃的五环三萜化合物，具有很强的抗炎与抗肿瘤活性[21]。但目前对桃金娘叶中三萜的具体生物活性的研究相对较少。

4 结论

本研究通过对不同采摘时期桃金娘叶中三萜含量进行测定，结果显示5月14日至7月24日采摘的桃金娘叶中三萜类物质含量相对较高。研究结果为桃金娘作为功能性食品的研究开发提供参考。在今后的研究中，有必要对桃金娘活性化合物及其生物活性进行深入研究，为开发新的保健功效桃金娘产品提供理论基础。