越橘花青素的纯化工艺及其食用安全性研究

2023-08-07 07:37郝长伟柴发永
现代食品 2023年11期
关键词:越橘样液大孔

◎ 郝长伟,柴发永

(1.包头东宝生物技术股份有限公司,内蒙古 包头 014030;2.山东省食品药品审评查验中心,山东 济南 250014)

越橘是杜鹃花科植物,属于低糖水果,味道酸甜可口,可鲜食,亦可制作果酱等食品。越橘中含有丰富的花青素,是一种天然抗氧化剂,具有抗氧化、保护视力、修复肌肤、调节血脂、抗癌症等多种功效,其营养价值极高,是食品加工等领域的热门原料[1]。但鲜有文章报道越橘花青素的纯化工艺及其食用安全性,本试验采用大孔树脂吸附法对越橘花青素进行分离纯化,通过单因素试验确定其最佳工艺条件,并进行大鼠30 d喂养试验,为高纯度、高收率的越橘花青素纯化工艺及其食用安全性研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

越橘鲜果,庄河市光华村巴尔虎屯种植基地;乙醇、甲醇、HCl、NaOH均为分析纯;超纯水;SPF级SD大鼠80只,雌雄各半,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

飞燕草素标准品(四川省维克奇生物科技有限公司),DM21大孔树脂(山东鲁抗立科药物科技有限公司),AB-8大孔树脂(天津南开大学化工厂),XAD-7HP大孔树脂(北京慧德易科技有限责任公司),AB204-S型电子分析天平(德国Sartorius),HH-S8型数显恒温水浴锅(常州国宇仪器制造有限公司),SHZ-D Ⅲ型水浴恒温振荡器(上海精宏实验设备有限公司),SJ-4型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂),TU-18010紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司),BD-SW50光学显微镜(深圳市博视达光学仪器有限公司),URIT-8036全自动生化分析仪(成都一科仪器设备有限公司),N-1300S旋转蒸发仪(东京理化器械株式会社)。

1.2 试验方法

1.2.1 越橘花青素粗提液的制备

取适量越橘鲜果,压榨后分离出果渣,加入50%乙醇,料液比为1∶6,提取温度62 ℃,提取2次,每次2 h,合并提取液,4 000 r·min-1离心15 min,取上清液,旋转蒸发浓缩提取液,除去乙醇,用蒸馏水定容,得越橘花青素粗提液。

1.2.2 吸光度的测定

精密称取飞燕草素对照品5 mg,加入2%盐酸-甲醇定容至25 mL,精密称取1 mL溶液于25 mL容量瓶中,用2%盐酸-甲醇定容至刻度线,即为对照品溶液。精密称取对照品溶液,加2%盐酸-甲醇稀释至飞燕草素质量浓度为1.10 μg·mL-1、3.31 μg·mL-1、5.52 μg·mL-1、6.62 μg·mL-1、8.83 μg·mL-1。以2%盐酸-甲醇溶液为空白,采用紫外可见分光光度法,测定540 nm波长处吸光度。以飞燕草素浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,得回归方程y=0.099 6x+0.035 6,R2=0.999 1,线性关系良好。以2%盐酸-甲醇作为空白试剂,取适量待测溶液,测定540 nm处吸光度。

1.2.3 大孔树脂预处理

将大孔树脂浸入95%乙醇溶液,室温下浸泡24 h,去除树脂表面吸附的杂质和污染物,用蒸馏水清洗至pH值中性且无醇味,加入3% HCl水溶液室温下浸泡3 h,用蒸馏水洗至pH值中性,彻底去除残留的酸性物质;加入3% NaOH溶液室温下浸泡3 h,用蒸馏水洗至pH值中性,备用。

1.2.4 大孔树脂静态吸附、解吸性能研究

分别称取2 g预处理好的XAD-7HP、AB-8、DM21大孔树脂放入150 mL锥形瓶中,加入10 mL越橘花青素粗提液(吸光度值为A0),并封口置于摇床中,25 ℃恒温振荡12 h,测定溶液吸光度值A1,并计算3种大孔树脂对越橘花青素的饱和吸附率。

分别取一定量已饱和的大孔树脂,加入50 mL 80%酸性乙醇溶液,于25 ℃下振荡解吸12 h,使吸附在大孔树脂中的越橘花青素逐渐解吸,测定解吸后的溶液吸光度值A2,并计算3种大孔树脂对越橘花青素的解吸率。

以大孔树脂对越橘花青素的饱和吸附率和解吸率为指标,考察大孔树脂静态吸附、解吸性能,筛选出最佳的大孔树脂。吸附率和解吸率计算如式(1)和式(2)所示。

1.2.5 大孔树脂静态吸附、解吸试验

称取最佳大孔树脂2 g,滤纸拭干表面水分,置于锥形瓶中,加入50 mL越橘花青素粗提液,封口振荡,测定24 h溶液吸光度,计算吸附率,绘制静态吸附平衡曲线。

取上述已吸附饱和的大孔树脂于锥形瓶中,加入80%酸性乙醇溶液50 mL,封口振荡,测定24 h溶液吸光度,计算解吸率,绘制静态解吸平衡曲线。

1.2.6 大孔树脂动态吸附、解吸试验

(1)上样液浓度的研究。分别取5份越橘花青素粗提液,加蒸馏水稀释至质量浓度为0.2 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、1.4 mg·mL-1、1.8 mg·mL-1,控制吸附流速相同,测定动态吸附试验前后溶液吸光度值A,计算吸附率。

(2)上样液pH值的研究。分别取5份2 mL越橘花青素粗提液置于10 mL容量瓶中,加蒸馏水定容,调节溶液pH值分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0,控制流速相同,测定动态吸附试验前后溶液吸光度值A,计算吸附率。

(3)吸附流速的研究。分别取5份2 mL越橘花青素粗提液置于10 mL容量瓶中,加蒸馏水定容,控制溶液吸附流速分别为0.5 mL·min-1、1.0 mL·min-1、1.5 mL·min-1、2.0 mL·min-1、2.5 mL·min-1,测定动态吸附试验前后溶液吸光度值A,计算吸附率。

(4)洗脱液浓度的研究。分别称取5份2 g已吸附饱和的大孔树脂湿法装柱,控制洗脱流速相同,加蒸馏水冲洗,另取相同用量的50%、60%、70%、80%、90%乙醇冲洗柱子,测定动态解吸试验前后溶液吸光度值A,计算解吸率。

(5)洗脱液用量的研究。称取2 g已吸附饱和的大孔树脂湿法装柱,控制洗脱流速相同,加蒸馏水冲洗,另取乙醇冲洗柱子,每使用1 BV乙醇时收集1次洗脱液,进行动态解吸试验,记录溶液吸光度值A的变化。

(6)洗脱流速的研究。分别称取5份2 g已吸附饱和的大孔树脂湿法装柱,加蒸馏水冲洗,另取乙醇冲洗柱子,分别控制5个柱子洗脱流速为1.0 mL·min-1、1.5 mL·min-1、2.0 mL·min-1、2.5 mL·min-1、3.0 mL·min-1,测定动态解吸试验前后溶液吸光度值A,计算解吸率。

1.2.7 最佳纯化工艺参数验证

根据试验筛选出的最佳纯化工艺参数,进行3次验证试验,以吸附率和解吸率为指标,进行纯化工艺验证,并测定花青素含量。

1.2.8 大鼠30 d喂养试验

80只SD大鼠适应性喂养3 d,随机均分为对照组,越橘花青素低、中、高剂量组(1 g·kg-1、2 g·kg-1、4 g·kg-1)4组,低、中、高剂量组大鼠掺饲料喂食上述纯化工艺而得的越橘花青素,对照组给予正常饮食,连续30 d。记录各组大鼠一般情况、中毒及死亡情况。试验结束后禁食16 h,取血测定血液指标、血清生化指标;处死大鼠,称量肝、肾、脾、睾丸,计算脏器系数,取对照组和越橘花青素高剂量组大鼠主要脏器,进行病理学观察。

2 结果与分析

2.1 大孔树脂静态吸附、解吸性能分析

如表1结果显示,吸附率、解吸率均为XAD-7HP<AB-8<DM21,其中DM21大孔树脂对越橘花青素的吸附率、解吸率均在80%以上,故选DM21作为纯化树脂。

表1 3种大孔树脂静态吸附、解吸性能比较表

2.2 DM21大孔树脂对越橘花青素的静态试验结果分析

2.2.1 越橘花青素静态吸附平衡曲线

由图1可知,2.5 h时吸附率达到81.54%,3 h时吸附率达到81.88%,3~24 h吸附率基本恒定。考虑到生产效率,选择最佳吸附时间为2.5 h。

图1 静态吸附平衡曲线图

2.2.2 越橘花青素静态解吸平衡曲线

由图2可知,2 h时解吸率最大(93.45%),选择最佳解吸时间为2 h。

图2 静态解吸平衡曲线图

2.3 DM21大孔树脂对越橘花青素的动态试验结果

2.3.1 上样液浓度对大孔树脂吸附率的影响

由图3可知,上样液浓度为1.0 mg·mL-1时吸附率最大。上样液浓度继续增加,部分杂质被大孔树脂吸附,影响大孔树脂吸附花青素能力,降低了吸附率。因此,最佳上样液浓度为1.0 mg·mL-1。

图3 上样液浓度对大孔树脂吸附率的影响图

2.3.2 上样液pH值对大孔树脂吸附率的影响

由图4可知,当pH值为1.0~3.0时,大孔树脂吸附率逐渐增加,增加趋势较小,当pH值超过3.0时,吸附率显著下降,可能由于酸性环境减弱,样液中部分花青素在吸附前已分解,导致花青素含量减少,吸附率降低[3-4]。故调节上样液pH值为3.0后再进行吸附。

图4 上样液pH值对大孔树脂吸附率的影响图

2.3.3 吸附流速对大孔树脂吸附率的影响

由图5可知,当吸附流速到达1.5 mL·min-1时,吸附率最高。吸附流速继续增加,吸附率降低,可能是吸附流速过快,上样液中花青素与大孔树脂接触不充分,易出现过早泄露情况,导致吸附率降低[5]。因此,选择流速为1.5 mL·min-1进行吸附。

图5 吸附流速对大孔树脂吸附率的影响图

2.3.4 洗脱液浓度对大孔树脂解吸率的影响

由图6可知,当乙醇浓度为80%时,解吸率出现最大值。研究显示,花青素与乙醇溶液、大孔树脂之间均存在分子间作用力,两个作用力处于平衡状态时,大孔树脂吸附的花青素易被洗脱至乙醇溶液中[4]。因此,选择80%乙醇作为洗脱液。

图6 洗脱液浓度对大孔树脂解吸率的影响图

2.3.5 洗脱液用量对大孔树脂解吸率的影响

由图7可知,从3 BV起始,随着洗脱液用量继续增加,溶液吸光度值趋向平稳状态。因此,选择洗脱液用量为3 BV。

图7 洗脱液用量对大孔树脂解吸率的影响图

2.3.6 洗脱流速对大孔树脂解吸率的影响

由图8可知,随着洗脱流速的增加,解吸率先升高后降低。主要因为洗脱流速过快,洗脱液无法充分接触大孔树脂,花青素析出量减少,导致解吸率降低[5]。因此,选择2.0 mL·min-1作为洗脱速率。

图8 洗脱流速对大孔树脂解吸率的影响图

2.4 最佳纯化工艺参数验证

选用DM21大孔树脂进行吸附,上样液浓度为1.0 mg·mL-1,pH值为3.0,吸附流速为1.5 mL·min-1,吸附2.5 h;选择80%乙醇作为洗脱液,洗脱流速为2.0 mL·min-1,洗脱液用量为3 BV(即60 mL),洗脱2 h。在此基础上进行工艺验证,并测定花青素含量,结果见表2。

表2 工艺验证试验结果表

2.5 大鼠30 d喂养试验结果

2.5.1 大鼠一般情况、中毒及死亡情况

试验期间,各组大鼠生长发育良好,未见异常体征,行为活动正常,摄食摄水如常,无中毒及死亡情况。

2.5.2 大鼠血液、血清指标及主要脏器系数结果

与对照组相比,给予大鼠不同剂量越橘花青素30 d后,越橘花青素各剂量组大鼠血液学指标(红细胞数、血红蛋白、血小板、血细胞数、中性粒细胞、淋巴细胞和其他细胞)、血清生化指标(谷草转氨酶、谷丙转氨酶、总蛋白、白蛋白、总胆固醇、甘油三酯、血糖、肌酐和尿素氮)及脏器系数(肝重、肝/体重、肾重、肾/体重、脾重、脾/体重、睾丸重和睾丸/体重)均无显著性差异。

2.5.3 病理学组织检查结果

各组大鼠主要脏器外形、体积、色泽、构造均未见异常;显微镜下观察,各组大鼠主要脏器组织未见明显病理变化。

3 结论与讨论

大孔树脂是一种经济、可持续和环保的分离纯化技术,对不同种类的花青素具有选择性吸附,可以在纯化过程中达到高效、高选择性和高质量的目标[6]。本试验选用最佳吸附树脂DM21进行越橘花青素纯化试验,得到最佳纯化工艺:上样液浓度1.0 mg·mL-1、上样液pH=3.0、吸附流速1.5 mL·min-1、吸附2.5 h;洗脱剂浓度80%、洗脱液用量为3 BV(60 mL)、洗脱流速2.0 mL·min-1、洗脱2 h。经验证,纯化工艺稳定,越橘花青素含量最高可达27.1%。经大鼠30 d喂养试验,越橘花青素各剂量组与对照组比较,各检验项目均无显著性差异,主要脏器组织无明显损伤性病理变化,说明越橘花青素无毒性作用。越橘花青素是目前发现最有效的植物抗氧化剂,应用前景广阔,值得进一步深入研究。

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