狼毒大戟调节AGE-RAGE信号通路对肝硬化大鼠炎症反应和纤维化的影响

刘露 刘占奎 吴雪 鲍婷琦

(齐齐哈尔市第一医院药学部,黑龙江 齐齐哈尔 161005)

肝硬化是指由于长期损害导致肝脏无法正常运作,进而引起肝组织瘢痕形成,是一种以晚期纤维化、再生结节形成和血管重塑为特征的弥散过程,其发生在肝损伤的其他阶段之后,也被称为肝病终末期〔1,2〕。肝移植是治疗终末期肝硬化最有效的方法,但供体短缺、并发症风险仍然是当前存在的问题〔3〕。因此,迫切需要新的治疗方法来替代肝移植。晚期糖基化终产物(AGEs)是通过糖分子和蛋白质结合的非酶促反应形成的,并且通常在健康个体中的存在程度较低〔4〕。AGEs可通过与其细胞表面受体-糖基化终产物受体(RAGE)相互作用,激活下游信号级联〔5〕。有研究发现,AGE-RAGE相互作用能够导致肝脏脂肪堆积,从而引起炎症、纤维化及脂肪肝疾病等其他并发症〔6〕。狼毒大戟具有抗炎、抗菌、抗病毒和抗肿瘤等多种活性〔7〕。目前已有研究发现,狼毒大戟配伍大枣能够有效减轻肝硬化大鼠的增生程度〔8〕。但其具体的分子作用机制还不了解。本研究旨在探讨狼毒大戟是否可以通过调节AGE-RAGE信号通路来减轻肝硬化大鼠的炎症反应和纤维化程度。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 SPF级SD雄性大鼠60只,体质量为180～210 g,购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司,许可证号:SCXK(湘)2019-0004。

1.1.2主要试剂 狼毒大戟(HPLC≥98%,上海雅吉生物科技有限公司);复方鳖甲软肝片(内蒙古福瑞医疗科技股份有限公司,国药准字Z19991011);丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)检测试剂盒(货号:SH-1271、SH-1273,北京凯诗源生物科技有限公司);透明质酸(HA)、Ⅳ型胶原(CⅣ)、层黏蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)检测试剂盒(货号:XY-SJH-3630、XY-SJH-3407、XY-SJH-3874、XY-SJH-3686,上海烜雅生物科技有限公司);肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6和IL-8试剂盒(货号:SBJ-R0040、SBJ-R0755、SBJ-R0033,南京森贝伽生物科技有限公司);苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(货号:YT8991,北京伊塔生物科技有限公司);AGE、RAGE一抗(货号:ab23722、ab216329,英国abcam公司);山羊抗兔IgG二抗(货号:FNab09778,武汉菲恩生物科技有限公司)。

1.2大鼠模型建立 将大鼠先进行适应性饲养1 w,然后随机分为两组,第一组作为对照组(n=15)用正常饲料饲养,第二组(n=45)参照文献〔9〕方法建立肝硬化大鼠模型,通过腹腔注射5 ml/kg的40%四氯化碳(CCl4,稀释于橄榄油中)诱导肝硬化,每周注射2次,持续8 w。

1.3大鼠分组及给药 将建立模型的第二组大鼠分为模型组、阳性组、狼毒大戟组,每组15只。阳性组大鼠以0.8 g/kg的剂量灌胃给药复方鳖甲软肝片〔10〕,狼毒大戟组灌胃给予30 mg/kg的狼毒大戟提取物〔8〕,对照组和模型组均灌胃给予等体积生理盐水。每周2次,共持续4 w。

1.4检测大鼠血清肝功能酶-ALT、AST和肝纤维化四项-HA、CⅣ、LN和PCⅢ的含量 将所有大鼠使用1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉,然后腹主动脉采血,3 000 r/min离心15 min,收集上清并保存于-20 ℃备用。分别利用试剂盒检测肝功能酶和肝纤维4项中各项指标的含量。

1.5酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-8的含量 取1.2中冻存的血清置于冰上溶解,先分别利用ELISA试剂盒中的标准品制作标准曲线,然后根据操作步骤处理待测样品,并用酶标仪检测待测样品在450 nm处的吸光值,并根据标准曲线计算TNF-α、IL-6、IL-8的含量。

1.6HE染色观察大鼠肝组织病理学形态 将所有大鼠麻醉后处死,取肝组织冻存于-80 ℃。然后在每组中随机取5只大鼠的肝组织于4%多聚甲醛中固定过夜,并进行石蜡包埋和切片。然后将切片在梯度乙醇中脱水,用二甲苯清洁,并用蒸馏水洗涤。随后,切片用苏木素染色4 min,再用伊红溶液染色2 min。然后,将切片分别用梯度乙醇和二甲苯脱水透明,最后用中性胶封片,在光学显微镜下观察肝组织病理学变化。

1.7RT-qPCR检测肝组织中α-SMA和ColⅠ mRNA的表达 从1.5中冻存的肝组织中每组随机选取5个,提取总RNA,然后根据一步法荧光定量试剂盒配制总反应体系25 L,反应程序:50 ℃逆转录3 min;95 ℃预变性30 s;2步法:95 ℃变性10 s,60 ℃退火30 s,40个循环,熔解曲线95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。以GAPDH为内参,采用2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。引物序列如下:α-SMA:上游 5′-CAATGGCTCCGGGCTCTGTA-3′,下游 5′-CTCTTGCTCTGCGCTTCGTC-3′;ColⅠ:上游 5′-CCTTTCTCCACCCCCTCTT-3′,下游 5′-TGTGTCTT TGGGGGAGACTT-3′;GAPDH:上游 5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′,下游 5′-AAGTGGTCGTTGAG-GGCAATG-3′。

1.8Western印迹检测肝组织中AGE、RAGE蛋白的表达 取1.5中剩余的肝组织加入蛋白裂解液提取总蛋白,并利用二喹啉甲酸(BCA)试剂盒测定蛋白质含量。然后用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白,并转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。再将PVDF膜放入5%脱脂牛奶封闭液中常温孵育2 h,然后与一抗稀释液(AGE、RAGE稀释比例1∶1 000)在4 ℃孵育过夜,接着与山羊抗兔IgG二抗稀释液(1∶1 000)在室温下孵育1 h。最后加入显影剂显色。以GAPDH为内参,分别用蛋白凝胶成像系统和ImageJ软件观察蛋白条带并分析蛋白相对表达量。

1.9统计学分析 采用GraphPad Prism8.0软件进行方差分析,两两比较采用SNK-q检验。

2 结 果

2.1狼毒大戟对肝硬化大鼠血清中肝功能指标的影响 与对照组相比,模型组、阳性组、狼毒大戟组血清中肝功能指标ALT、AST含量明显升高(P<0.05);与模型组相比,阳性组和狼毒大戟组血清中肝功能指标ALT、AST含量明显降低(P<0.05),且狼毒大戟组与阳性组无显著差异(P>0.05),见表1。

表1 各组血清中肝功能指标、肝纤维化4项水平比较

2.2狼毒大戟对肝硬化大鼠血清中肝纤维化4项指标的影响 与对照组相比,模型组、阳性组、狼毒大戟组血清中肝纤维化4项指标HA、CⅣ、LN和PCⅢ含量明显升高(P<0.05);与模型组相比,阳性组和狼毒大戟组血清中肝纤维化4项指标HA、CⅣ、LN和PCⅢ含量明显降低(P<0.05),且狼毒大戟组与阳性组无显著差异(P>0.05),见表1。

2.3狼毒大戟对肝硬化大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-8含量的影响 与对照组相比,模型组中、阳性组、狼毒大戟组血清中TNF-α、IL-6、IL-8含量明显升高(P<0.05);与模型组相比,阳性组和狼毒大戟组血清中TNF-α、IL-6、IL-8含量明显降低(P<0.05),且狼毒大戟组与阳性组无显著差异(P>0.05),见表2。

表2 各组血清中TNF-α、IL-6、IL-8含量及肝组织中α-SMA、ColⅠ mRNA、AGE、RAGE蛋白水平比较

2.4狼毒大戟对肝硬化大鼠肝组织中α-SMA和ColⅠ mRNA水平的影响 与对照组相比,模型组、阳性组、狼毒大戟组肝组织中α-SMA和ColⅠ mRNA水平明显升高(P<0.05);与模型组相比,阳性组和狼毒大戟组肝组织中α-SMA和ColⅠ mRNA明显降低(P<0.05),且狼毒大戟组与阳性组无显著差异(P>0.05),见表2。

2.5狼毒大戟对肝硬化大鼠肝组织中AGE、RAGE蛋白表达的影响 与对照组相比,模型组、阳性组、狼毒大戟组肝组织中AGE、RAGE蛋白表达明显升高(P<0.05);与模型组相比,阳性组和狼毒大戟组肝组织中AGE、RAGE蛋白表达明显降低(P<0.05),且狼毒大戟组与阳性组无显著差异(P>0.05),见表2、图1。

1～4:对照组、模型组、阳性组、狼毒大戟组图1 各组肝组织中AGE、RAGE蛋白表达

2.6狼毒大戟对肝硬化大鼠肝组织的影响 与对照组相比,模型组肝组织中细胞排列紊乱,细胞出现肿胀,纤维组织增生,肝小叶结构被破坏;与模型组相比,阳性组和狼毒大戟组肝组织中细胞整体排列有序,纤维化程度减轻,细胞肿胀和纤维增生明显减少,见图2。

图2 各组肝组织的病理形态(HE染色,×400)

3 讨 论

肝硬化是与肝细胞损伤和炎症相关的慢性肝病末期。在组织学上,肝硬化的特征是弥漫性结节状再生,周围环绕着纤维化隔膜〔11〕。在肝硬化发展中,虽然肝移植是一个可行的治疗选择,但其存在缺乏供体器官、免疫排斥和术后并发症等多种限制,且尚无治疗肝硬化的有效药物用于临床。因此,迫切需要一种不同类型的治疗方法〔12,13〕。狼毒大戟首载于《神农本草经》,其以根入药,味辛、性平、有毒,其主要包括二萜类、三萜类、香豆素类、酚酸类、淄醇类等多种活性成分,具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤及抗癫痫等多种药理作用〔14〕。本研究结果表明,狼毒大戟通过抑制肝功能酶的含量减轻肝功能损伤。已知肝硬化也是肝纤维化和肝脏炎症导致的终末期肝病,其中肝星状细胞的激活是肝纤维化的关键步骤,因为它会导致α-SMA和ColⅠ的积累〔15〕。炎症作为慢性肝病的主要特征,可以发生在纤维化过程的任何阶段,并引起TNF-α、IL-6、IL-8等促炎因子的分泌〔16〕。本研究结果揭示,狼毒大戟可以抑制肝硬化大鼠的炎症反应和纤维化程度,并且减轻肝组织病理性损伤;但其作用机制还尚未了解。

已知AGEs是由葡萄糖或其他糖类对包括蛋白质、脂质和核酸在内的大分子进行翻译后非酶修饰而产生的异质分子。AGE是有害分子,在生理衰老和年龄相关疾病、糖尿病、类风湿关节炎及系统性硬化症等疾病中增加〔17〕。RAGE是AGE的细胞结合受体,两者相互作用可以激活NADPH氧化酶和核因子(NF)-κB,从而导致各种炎症基因的转录激活〔18,19〕。有研究AGEs通过自噬诱导和肝星状细胞激活在慢性丙型肝炎患者的纤维化或肝硬化中发挥作用,阻断AGE-RAGE信号可能是缓解纤维化的一种有前途的方法〔20〕。本研究推测狼毒大戟对肝硬化大鼠炎症和纤维化的减轻作用可能是通过抑制AGE-RAGE信号通路实现的,且与阳性药物的效果无显著差异。

综上,狼毒大戟可以通过抑制AGE-RAGE信号通路来减轻肝硬化大鼠的炎症反应和纤维化程度。本研究为治疗肝硬化提供了新的药物及研究思路。但肝硬化是大多数肝病末期,其治疗较为困难,因此,狼毒大戟对肝硬化的临床应用还有待进一步深入研究。