加味二陈汤对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能及ASMCs作用的相关机制

郑忻 曲妮妮 王丽娜 王国力 李思佳 秦一冰 姜玉洁 马金娜

(1辽宁中医药大学附属医院呼吸与危重症医学一科/肺病一科,辽宁 沈阳 110032;2辽宁中医药大学)

调查表明,慢性阻塞性肺疾病发病率每年以10%趋势上涨,目前已经成为全球排名第四位危害性疾病,慢性阻塞性肺疾病发病原因呈现多样性,包括环境原因和自身原因〔1〕。慢性阻塞性肺疾病患者时常咳嗽、出现呼吸不顺、胸口闷、易喘息等情况,会造成患者体内肺组织的改变,甚至波及气道,使肺泡受到损伤,从而加快平滑肌细胞(ASMCs)功能的紊乱和失调,肺功能明显降低〔2〕。而Janus激酶/转录激活子(JAK/STAT)信号传输路径与慢性阻塞性肺疾病的发生密切有关,慢性阻塞性肺疾病患者JAK/STAT信号传递路径异常活跃,STAT信号通路通过激酶反应增加活性使自己磷酸化,特定靶基因受到磷酸化的STAT影响,开始转录功能,并诱导相关蛋白,影响细胞增殖、分化和凋亡,抑制这一通路将成为治疗慢性阻塞性肺病的新靶点〔3,4〕。加味二陈汤首次出现在《太平惠民和剂局方》中,具有中和理气的作用,在改善慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能方面效果明显〔5〕,但其作用机制尚不明确,本研究探讨加味二陈汤对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能及ASMCs的作用机制。

1 材料和方法

1.1试验药物 加味二陈汤中含麻黄6 g、半夏、姜10 g、葶苈子10 g、茯苓15 g、地龙10 g、陈皮10 g、党参10 g、白术10 g、苦杏仁10 g、山药10 g、干姜5 g、甘草6 g,所有中药购自安徽援康中药材种苗生产有限公司,敲碎,上述药物加4 800 ml蒸馏水浸泡20 min后常规煎煮1.5 h。过滤药液,滤渣再煎煮1次,合并两次滤液,浓缩至0.5、1.0、2.0 g/ml,贮存于4 ℃冰箱备用。根据人体给药比例换算大鼠给药比例〔6〕,将加味二陈汤分为5、10、20 g/kg 3个剂量给大鼠灌胃。

1.2动物 50只SPF级雄性大鼠(辽宁中医药大学实验动物中心),体质量(255±16.26)g,6月龄,购自辽宁省动物实验中心,许可证编号:SCXK(辽)2018-0001,饲养温度为22～26 ℃,相对湿度40%～60%,黑白昼夜交替(均12 h),动物自由饮水与进食。本试验经辽宁中医药大学实验动物中心伦理委员会批准审核(批件号:2019007)。

1.3试剂 Trizol试剂(浙江AMEKO公司,批号:15140-122 ),逆转录试剂盒(武汉赛维尔生物科技有限公司,批号:K1622),STAT3抗体(艾美捷科技有限公司,批号:PAB7090),JAK3抗体(武汉恒意赛生物科技有限公司,批号:ELK4794),RT-聚合酶链反应(PCR)试剂盒(上海优予生物科技有限公司,批号:HS0612-2),苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(碧云天生物技术有限公司,批号:C0105),胎牛血清(FBS,美国GIBCO公司,批号:LOT#2036224C)。

1.4仪器 M276407 肺功能测定仪(北京中西华大科技有限公司),QTOWER2.2 PCR仪(西安欧拓机电设备有限公司),Chemi DocTMTouch imaging systerm凝胶图像分析仪(成都百乐科技有限公司),BY/TD-3A离心机(北京海富达科技有限公司),RM2245石蜡切片机(德国莱卡公司);BX53型生物显微镜(奥林巴斯公司);1510酶标仪(赛默飞世尔有限公司)。

1.5方法

1.5.1动物建模 50只大鼠分为正常对照组、模型对照组、加味二陈汤5 g/kg组、加味二陈汤10 g/kg组、加味二陈汤20 g/kg组,采用气管内注入2次脂多糖(LPS)诱导+烟熏4 w建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型〔5〕,大鼠麻醉后仰卧固定并将1 μg/ml LPS 200 μl滴注入气管中,注意防止窒息,持续给予2 w,同时准备熏箱将大鼠放入,熏香烟烟雾8支/次,每天2次,连续4 w,正常对照组不需建立慢性阻塞性肺疾病模型,仅给予生理盐水灌胃,连续2 w。

1.5.2肺功能检测 灌胃2 w后麻醉大鼠,将器官分离置入Y型管,两端分别与流速、压力传感器连接,再连接至小动物呼吸机上,维持平静呼吸3 min并连接Maclab数据分析系统,3 min后给予一定气量充气模仿深呼吸,利用微机处理计算大鼠肺功能指标包含用力呼气量/用力肺活量(FEV0.3/FVC)、动态肺顺应性(Cdyn)及呼吸指数(RI)。

1.5.3ASMCs细胞收集 肺功能测定完毕后,处理大鼠分离叶支气管,剪成1 mm×1 mm消化后加入DMEM液,用200目过滤网过滤,离心,保留沉淀细胞,用100 U/ml青霉素的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗,精细分离处理得到大鼠气道平滑肌块,切碎后置入37 ℃培养箱中加入500 μl DMEM高糖+20% FBS的培养基,培养4 h,收集4～6代的细胞用于后续实验。小鼠平滑肌α-肌动蛋白(actin),免疫细胞化学染色鉴定为ASMCs。

1.5.4HE染色 取肺组织标本采用标本刀切成4 mm的标本,采用甲醛固定60 min,进行脱水,浸蜡,制片,厚度为3～4 μm,苏木素和伊红染色液复染分别为6～8 min和10 s,与显微镜下观察肺组织形态。按照Mikaw方法〔7〕对肺组织病理进行半定量评分,具体可分为4类:肺泡结构、肺上皮细胞、管腔情况及炎性细胞浸润,其中0分为无病变、1分为轻度病变、2分为中度病变、3分为重度病变,各项评分之和为肺组织病理得分。随机抽取各组北航医学图像分析管理系统截取图片,测量其平滑肌的厚度,求其均值。

1.5.5RT-PCR检测ASMCs中JAK3、STAT3 mRNA表达 ASMCs细胞总RNA采用Trizol法来提取,总RNA提取反转录成 cDNA,按全说明书进行实验,用DNA荧光染料SYBR GreenⅠ对JAK3、STAT3 mRNA表达水平进行检测,qPCR引物由生工生物公司合成,内参采用GAPDH,60 ℃,10 min、95 ℃、72 ℃,各 30 s、95 ℃,5 min,循环40次,以ImageJ等软件对结果进行分析,用相对定量2-ΔΔCt计算目的基因JAK3、STAT3 mRNA相对表达量。引物序列为:JAK3正向:5′-CTCCTTCCGAGC-CGTCAT-3′,反向:5′-CTCCCGCTGAGTCCT-3′;STAT3正向:5′-GCGGC-AGTTTCTGGCCCCTT-3′,反向:5′-CGGGCCACAATCCGGGCAAT-3′;磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)正向:5′-GGGAAACTGTGG-CGTGAT-3′,反向:5′-GAGTGGG TGTCGCTGTTGA-3′。

1.5.6Western印迹检测ASMCs中JAK3、STAT3蛋白表达 ASMCs细胞加入100 μg的胰蛋白酶裂解30 min,10 000 r/min 4 ℃离心5 min,取上清液,用5×上样缓冲液混合于PBS稀释蛋白样品中,按照4∶1的比例进行,然后在沸水浴中煮沸5 min,采用二喹啉甲酸(BCA)法测总蛋白浓度,每孔上样蛋白量20 μg,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。缓冲液配制好后要放入4 ℃冰箱内预冷,然后全部转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,再把脱脂奶粉加入,全程封闭时长为1 h,然后加入一抗(稀释比例1∶500,购自沈阳万类生物科技有限公司)后,TTBS漂洗3 次,每次10 min;4 ℃过夜,加入辣根根过氧化物酶标记二抗(稀释比例1∶2 500,购自沈阳万类生物科技有限公司),37 ℃孵育45 min,TTBS漂洗10 min×3次,加于膜上,使用Image-Pro Plus v6软件分析JAK3、STAT3蛋白的相对表达量。

1.6统计学分析 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1加味二陈汤对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能的影响 与正常对照组比较,模型对照组肺功能显著降低,FEV0.3/FVC、Cdyn值明显降低,RI值明显升高(P<0.001);加味二陈汤5 g/kg组、加味二陈汤10 g/kg组、加味二陈汤20 g/kg组肺功能均明显优于模型对照组,且加味二陈汤20 g/kg组肺功能改善最显著(均P<0.05)。见表1。

表1 加味二陈汤对慢性阻塞性肺病大鼠肺功能、气道平滑肌和ASMCs中JAK3、STAT3 mRNA及蛋白表达的影响

2.2加味二陈汤对慢性阻塞性肺疾病大鼠气道平滑肌的影响 与正常对照组比较,模型对照组气道平滑肌厚度显著提高(P<0.001);与模型对照组比较,加味二陈汤5 g/kg组、加味二陈汤10 g/kg组、加味二陈汤20 g/kg组气道平滑肌厚度均明显降低,且加味二陈汤20 g/kg组大鼠气道平滑肌厚度降低最显著(P<0.05),提示慢性阻塞性肺疾病大鼠气道壁显著增厚。见表1。

2.3加味二陈汤对慢性阻塞性肺疾病大鼠ASMCs中JAK3、STAT3 mRNA及蛋白表达的影响 与正常对照组比较,模型对照组ASMCs中JAK3、STAT3 mRNA及蛋白表达明显增加(P<0.001);与模型对照组比较,加味二陈汤5 g/kg组、加味二陈汤10 g/kg组、加味二陈汤20 g/kg组ASMCs中JAK3、STAT3 mRNA及蛋白表达明显降低,且加味二陈汤20 g/kg组ASMCs中JAK3、STAT3 mRNA及蛋白表达降低更显著(P<0.05)。见表1、图1。

1～5:正常对照组、模型对照组、加味二陈汤5 g/kg组、加味二陈汤10 g/kg组、加味二陈汤20 g/kg组图1 加味二陈汤对慢性阻塞性肺疾病大鼠ASMCs中JAK3、STAT3 蛋白表达的影响

2.4加味二陈汤对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织病理学观察 正常对照组肺泡结构完整,无毛细血管出血、水肿、炎性细胞出现；模型对照组肺泡结构不完整,大小不均,肺组织间有轻微毛细血管充血,肺间质轻微水肿,肺泡腔也存在炎性细胞;而加味二陈汤20 g/kg组肺泡结构、毛细血管充血程度、肺间质水肿程度及炎性细胞浸润明显少于加味二陈汤5 g/kg组和加味二陈汤10 g/kg组。见图2。正常对照组、模型对照组、加味二陈汤5 g/kg组、加味二陈汤10 g/kg组、加味二陈汤20 g/kg组肺组织病理半定量评分为〔(1.17±0.23)分、(2.39±0.57)分、(1.91±0.52)分、(1.68±0.44)分、(1.36±0.31)分〕。与正常对照组相比,模型对照组肺组织病理半定量评分明显升高(P<0.001);与模型对照组相比,加味二陈汤5 g/kg组、加味二陈汤10 g/kg组、加味二陈汤20 g/kg组肺组织病理半定量评分均明显降低(均P<0.05),且呈药物依赖性。

图2 各组肺组织病理学(HE染色,×200)

3 讨 论

慢性阻塞性肺疾病是以气流限制为特征的肺疾病,临床上存在不完全可逆的进行性发展,对患者的生存质量及日常劳动造成巨大的影响,增加患者及家属的心理和经济负担。研究表明,我国慢性阻塞性肺疾病患者逐年增多,2015年我国有33万人患有慢性阻塞性肺疾病且因其死亡,已经成为危害我国国民身体健康的严重病症之一〔8〕。慢性阻塞性肺疾病的发病原较为多样且影响因素较多,有环境原因和自身原因,外在因素有长时间吸烟等,自身因素可能与家族遗传有关系,因此采取有效方法治疗慢性阻塞性肺疾病显得至关重要〔9〕。

本研究说明,加味二陈汤可改善慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能及气道平滑肌厚度。FEV0.3/FVC是评价肺功能的重要指标,慢性阻塞性肺疾病存在肺组织病理学改变,因气流阻塞、小呼吸指数增高、Cdyn下降,降低肺功能,RI是能够反映肺通气和氧交换功能,可作为评价呼吸功能减低的一个指数,参与慢性阻塞性肺疾病的进展。有研究发现,慢性阻塞性肺疾病大鼠平滑肌细胞增长较快,平滑肌增厚能够影响慢性阻塞性肺疾病大鼠的气道重塑,且与大鼠肺功能及Cdyn水平有显著的关系〔10〕。李才元等〔11〕研究加味二陈汤能够有效抑制体外培养的平滑肌细胞活性及有丝分裂反应,在慢性阻塞性肺疾病大鼠使用加味二陈汤进行治疗可以有效控制气管重塑,降低呼吸指数,改善FEV0.3/FVC水平。有研究通过体外建立哮喘小鼠模型,给予加味二陈汤干预,结果显示小鼠气道厚度、平滑肌面积等均有所改善,肺功能显著提升,其通过转化生长因子-β1及组蛋白去乙酰化酶2基因表达水平来实现抑制哮喘小鼠的气道重塑的作用机制,且FEV0.3/FVC、呼吸阻抗及气道重塑之间相辅相成,关系密切,说明加味二陈汤对于哮喘小鼠气道重塑及肺功能改善有重要作用〔12,13〕。

相关研究证实,加味二陈汤通过气道上皮细胞、ASMCs、局部炎症细胞对慢性阻塞性肺疾病患者发挥治疗作用,对气道具有良好的局部抗炎症作用,减轻患者气道黏膜炎症反应,改善平滑肌厚度,提高患者肺功能〔14〕。加味二陈汤中白术,可入脾经,发挥补脾、益阴的作用,亦能固精,白术可提高人的抗病能力,并可扩张血管促进血液循环,对急性或慢性炎症有显著的改善作用,而汤中地龙、党参是扩张血管,促进血液循环的良药提高机体免疫的良药〔15〕。甘草首次出现在《神农本草经》中,书中记载了甘草的诸多药用机制,如滋润肺腑、清火气、解毒,现代研究也证明甘草可防治肺炎、调节免疫等作用〔16〕。这与本研究相符。研究发现,慢性阻塞性肺疾病会造成患者体内肺组织的改变,甚至波及气道使肺泡受到损伤,可以加快气道〔17,18〕。JAK/STAT是机体内的一条重要通路,JAKs、STATs与平滑肌细胞的凋亡增殖分化有密切的关系,同时在不同细胞因子的刺激下异常活化,发生信号转导而发生作用〔19〕。目前发现JAK主要有JAK1、JAK2、JAK3等,STAT是 JAKs的作用底物,有STAT1、STAT2、STAT3等多种表现形式。研究表明,慢性阻塞性肺疾病的发生发展和JAK/STAT信号通路的异常活化有关,慢性阻塞性肺疾病发生时JAK/STAT通路被激活,STAT的成分发生磷酸化,JAK/STAT通路残端亚基附着形成二聚体进入细胞核,调控靶基因转录,与其他信号通路共同作用参与疾病发展〔20〕。STAT3蛋白是一种异常活跃的转录因子,通过与JAK3激酶反应增加活性使自己磷酸化,特定靶基因受到磷酸化的STAT3影响,开始转录功能,同时促进ASMCs增殖,加快气道重塑反应〔21,22〕。气道病变过程中JAK/STAT信号在ASMCs增殖中有重要作用,在机体细胞免疫、气道反应中发挥重要职能,而加味二陈汤治疗时能明显提升慢性阻塞性肺疾病患者的肺功能,能长期抑制气道平滑肌的收缩,对气道扩张作用持久〔23〕。余仙娟等〔24〕通过建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型,给予保肺定喘干预后,结果表明保肺定喘汤可通过降低JAK、STAT1、STAT3表达水平来抑制慢性阻塞性肺疾病大鼠的肺血管重构,提高大鼠肺功能,降低呼吸指数〔24〕。JAK/STAT信号通路参与、调控多种组织、细胞、器官的生长发育,在炎症反应中发挥重要作用,加味二陈汤中含有甘草、白术等多种中药,对慢性阻塞性肺疾病有很好的治疗效果,其作用机制可能与JAK-STAT信号通路活性受到抑制有关〔25,26〕。

综上,加味二陈汤对慢性阻塞性肺疾病大鼠有明显治疗作用,能显著提高大鼠肺功能,其作用机制可能与抑制ASMCs中JAK/STAT信号活性有关。后期将通过给予JAK/STAT抑制剂进一步对慢性阻塞性肺疾病大鼠进行干预,探究加味二陈汤、JAK/STAT及慢性阻塞性肺疾病三者的作用机制。