刺五加-灵芝双向固体发酵工艺优化及抗氧化活性评价

孙琳, 井长欣, 邹睿, 辛宇, 张晓旭, 邱智东, 王伟楠

(长春中医药大学药学院, 长春 130117)

刺五加[Acanthopanaxsenticosus(Rupr. Maxim.) Harms]是五加科五加属的药食同源植物,在中国东北与河北等地分布较为广泛,具有补中益精、健脾安神等功效,因其保健功效与人参相近,故民间习称其为“五加参”[1-4]。截止到目前,已有大量研究报道了刺五加提取物及其富含的单体化学成分对神经、代谢、心脑血管及免疫系统具有生物活性,不同程度地阐明了其抗心肌损伤、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老和调节血糖、血压等作用机制,证明了其存在极高的经济社会利用价值和极大的待开发潜力[5-9]。然而,刺五加药用部位质地较为坚硬、组织致密,不利于活性成分的提取、溶出与生物利用;另外,刺五加提取物在高剂量应用时会产生不同程度的不良反应,而低剂量应用则生物活性并不显著[10]。所以,如何通过绿色的方法破坏刺五加药材非药用组织结构的壁垒、深度利用其活性成分,以提高药效并降低副作用,成为了当前刺五加药材开发的主要桎梏。

生物发酵是一种利用微生物自身代谢能力改造环境物质基础的技术,在中药材绿色加工和生物防治中的应用非常广泛[11]。通过微生物的代谢行为,可以对中药材进行有效的品质改良和成分提取,其主要的实施形式包括菌丝体发酵、细胞-微生物共培养和固体发酵[12]。双向固体发酵技术是以药用真菌为菌种发酵药材,发酵过程中利用药材中的非药用组织和成分为微生物的生长提供营养物质,并通过微生物自身的代谢行为转化药材原化学成分,形成新的功效物质基础[13-14],该方法可以有效地降解一些难以破碎的药材组织,高效释放其中的活性成分,通过生物转化降低药材毒性,并增加一些功效成分的生物利用度,以起到“增效减毒”的作用[15-16]。目前已有包括人参、雷公藤、马钱子、大黄、黄芪和西洋参等几十种中药材构建了双向固体发酵体系,为解决一些传统中药开发应用的弊病提供了有力的解决方案[17-21]。在构建双向发酵组合时,首要考虑的是药材与药用真菌之间的生物活性兼容性。鉴于刺五加和灵芝性味相近、均富含丰富的抗氧化物质,因此,二者的有机结合具有极大的抗氧化活性提升潜力[22-23]。然而,在双向发酵的实际操作过程中,由于药材质地、主要化学成分的抑菌性、细胞毒性及所含碳/氮源等其他因素的影响,并不是任意的中药-真菌组合都能展现出优良的发酵效果,因此需要进行系统的因素考察与参数优化,以在最短的发酵周期内获得最大的生物量[24]。为了实现刺五加-灵芝双向固体发酵体系的构建,现首先采用单因素实验对发酵工艺中的基本参数和生长因子品种进行考察,通过统计学设计和响应曲面分析,优化并验证发酵过程中的生长因子添加量,以确定最优发酵工艺,并对发酵前后的刺五加药材进行抗氧化活性的比对和评价,以期为刺五加发酵产物的工业化制备及产品开发利用提供良好的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

灵芝菌(Ganodermalingzhi)(菌种编号:CICC 14002)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心;刺五加(Acanthopanaxsenticosus)购自吉林大药房。

琼脂粉、葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、维生素B1购自北京Solarbio Science &Technology公司;CaCO3、CaCl2、MgSO4、MgCl2、MnSO4、MnCl2、CuSO4、KH2PO4、NaCl、HClO4、香草醛购自西陇化工股份有限公司;齐墩果酸对照品购自上海源叶生物科技有限公司;CH3OH、CH3COOH、C4H8O2、CHCl3购自北京化工厂;DPPH(二苯代苦味肼基)自由基清除能力测试试剂盒、SOD(超氧化物歧化酶)检测试剂盒、总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒购自北京Solarbio Science &Technology公司。

立式压力蒸汽灭菌器购自爱来宝(济南)医疗科技有限公司;HY60恒温摇床购自武汉汇诚生物科技有限公司;EL204电子天平、MS105DU电子天平购自瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司;DFY-200C粉碎机购自上海皓庄仪器有限公司;HH-M8水浴锅购自上海Herry Tech有限公司;微生物培养箱、超净工作台购自美国Thermo公司;SpectraMax i3x酶标仪购自Molecular Devices公司;L5S紫外分光光度仪购自上海科晓科学仪器有限公司;高速冷冻离心机购自广州吉迪仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基制备

固体培养基:马铃薯去皮切块,加蒸馏水加热,趁热过滤,滤液中加入琼脂和葡萄糖,完全溶解后补充水分(马铃薯20%,葡萄糖2%,琼脂2.4%, pH自然),趁热迅速将溶液分装于试管中,121 ℃灭菌20 min。

液体培养基:精密称定葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、酵母浸粉2 g、KH2PO41 g、MgSO40.5 g、CaCO30.1 g、MnSO40.1 g、维生素B110 mg,溶于1 000 mL蒸馏水中,充分溶解后于121 ℃灭菌20 min。

1.2.2 灵芝菌活化

使用接菌环刮取适量复苏后的灵芝菌菌丝体,划线接种于新的固体培养基中,设定培养条件为温度28 ℃,湿度40%,培养7～8 d,至白色菌丝铺满整个斜面,备用。

1.2.3 灵芝菌种子液培养

使用接菌环刮取适量灵芝菌斜面孢子至液体培养基中,稀释至1×107spores/mL,于28 ℃、130 r/min条件下培养5～6 d,即为一级种子液;将一级种子液按5%接种量接入新鲜液体培养基中,于28 ℃,130 r/min条件下培养6～7 d,当瓶子内布满均匀分布的星芒样菌丝球时,即为二级种子液,备用。

1.2.4 刺五加-灵芝双向固体发酵培养

称取10 g刺五加药材,剪碎并在锥形瓶中与一定体积的蒸馏水混合均匀,121 ℃,30 min高压灭菌一次,振摇松散后,备用。利用减压抽滤的方法在无菌滤膜上收集灵芝菌二级种子液中的菌丝体,然后按照一定比例与刺五加基质进行混合。在28 ℃,相对湿度40%条件下避光放置培养,当瓶子内部出现明显菌蕾结构、布满菌丝时,结束发酵。

1.2.5 刺五加-灵芝双向固体发酵工艺优化

1)单因素实验设计

以1.2.4节下培养条件,对刺五加不同粉碎粒度(10、24、50、65、80目);药材粉末加水量(体积/质量,mL/g,20%,30%,40%,50%,60%);不同比例灵芝菌接种量(灵芝菌丝体湿重∶刺五加固体培养基干重,质量/质量,g/g,0.5∶1,1∶1,1.5∶1,2∶1,2.5∶1),生长因子种类(10 mmol/kg MnCl2、CuSO4、MgCl2、CaCl2、NaCl)及生长因子水平(10、20 、40 、80、160 mmol/kg)进行单因素考察。

2)响应曲面实验设计

在单因素实验的基础上,以MnCl2(A)、NaCl(B)、CaCl2(C)添加量为自变量,以菌蕾干重和菌蕾总三萜含量为考察指标,将实验因素和水平分别设置3个,优化生长因子在刺五加药材基质中的相对加入量,Box-Behnken实验参数设置如表1所示。

表1 中心组合实验参数设置表

1.2.6 灵芝菌蕾干重及总三萜含量测定

1)菌蕾干重测定方法

刺五加-灵芝双向固体发酵至30 d后,分离菌蕾与刺五加药材,清洗菌蕾表面,降低有效部位混杂的可能性,将清洗后的菌蕾放入50 ℃真空干燥箱内干至恒重后称重,收集至干燥器内保存。

2)菌蕾总三萜含量测定方法[25]

供试品及对照品溶液的制备:精密称定干燥后的灵芝菌蕾0.1 g,剪碎后在20倍体积的CHCl3中浸泡30 min,超声提取2次,每次1 h,过滤后合并滤液并蒸干,加入CH3OH溶解定容至1 mg/mL即为供试品溶液。精密称定5 mg齐墩果酸对照品,于25 mL容量瓶中加入CH3OH溶解定容至0.2 mg/mL即为对照品溶液。

标准曲线的绘制:分别精密量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL对照品溶液于试管中水浴蒸干并放凉,精密加入0.8 mL HClO4、0.2 mL现制的5%香草醛-冰醋酸溶液,摇匀后于70 ℃水浴条件下加热15 min,随即冰浴5 min,精密加入4 mL C4H8O2,摇匀。在546 nm波长下,以无对照品加入的显色剂为空白,测定吸光度,绘制标准曲线,其中横坐标为对照品浓度,纵坐标为吸光度,得回归方程:Y=0.056 5X+0.013 9,R2=0.999 7。

三萜含量测定:于试管中精密量取0.2 mL供试品溶液,按照“标准曲线的绘制”操作步骤,从“水浴蒸干”开始,同流程测定吸光度,将其代入回归方程中求出总三萜含量。

1.2.7 刺五加-灵芝双向固体发酵产物的体外抗氧化活性评价

1)刺五加发酵产物和灵芝药材活性部位制备

参照《中国药典》2020年版中“刺五加浸膏”项下方法进行制备[26],流程简述如下:分别称取相同重量的刺五加-灵芝发酵产物、刺五加药材、灵芝药材以及刺五加-灵芝等比混合物(质量比为1∶1)的干燥粉末,加入10倍量75%乙醇溶液,回流12 h后过滤,浓缩滤液至无醇味的浸膏,在-100 ℃、99 Pa条件下冻干至恒重,备用。

2)DPPH自由基清除能力测定

参考何源等[27]描述的测定方法,分别精密称定刺五加发酵产物提取物、刺五加提取物、灵芝提取物和刺五加-灵芝混合提取物各10 mg,采用无水乙醇溶解后定容至10 mL,得1 mg/mL的母液。将4种母液分别稀释成120、160、200、240、300、400 μg/mL的供试品溶液,以评价其对DPPH自由基的清除能力,每个样品3个复孔。将供试品溶液与试剂盒中反应试剂混合均匀后,避光室温放置30 min,保持温度恒定,酶标仪检测波长设置为517 nm,测定此条件下不同组别的吸光度值,计算清除率C,公式为

(1)

式(1)中:A0为蒸馏水对照的吸光度值;A1为供试品的吸光度值;A2为供试品溶剂的空白对照吸光度值。

3)SOD活力测定

按照试剂盒中步骤进行测定。分别精密量取刺五加发酵产物提取物、刺五加提取物、灵芝提取物和刺五加-灵芝混合提取物20 mg,采用无水乙醇溶解后定容至10 mL,得2 mg/mL的母液。将4种母液分别稀释成0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0 mg/mL的供试品溶液。测定供试品对SOD的活力大小,每个样品重复测定3次,SOD活力计算公式为

(2)

式(2)中:OD为测定管OD值;OD0为对照管OD值。

4)T-AOC的测定

参考试剂盒提供的方法进行测定。分别精密量取刺五加发酵产物提取物、刺五加提取物、灵芝提取物和刺五加-灵芝混合提取物10 mg,采用无水乙醇溶解后分别配制成1 mg/mL的母液。将4种母液稀释成120、160、200、240、300、400 μg/mL的供试品溶液。测定以上供试品的总抗氧化能力,每个样品3个复孔。为每个样品做一个自身对照孔(即10 μL样本和180 μL蒸馏水混合后,静置6 min,405 nm处读吸光度值)排除待测样品的颜色干扰,将样本测定吸光度值(每个样品测定孔的吸光度值减去每个样本对应的自身对照孔的吸光度值)带入标准曲线计算。称取27.8 mg FeSO4·7H2O标准品,溶解定容到1 mL,浓度为100 mmol/L,将此溶液分别稀释至0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、2.1、3和4.2 mmol/L。拟合上述不同浓度标准品的吸光度值与其相应的浓度梯度后绘制标准曲线,将样品测定管的吸光度值代入曲线方程,即可得到结果。

1.2.8 数据处理

响应曲面实验由Design-Expert 12.0.3.0软件设计;其他相关数据与图表,均经过GraphPad Prism及Origin Pro软件处理得到。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 刺五加粉碎粒度对发酵周期的影响

如图1所示,刺五加不粉碎或粉碎粒度过小都会导致发酵周期大幅增长。粒度过小会导致空气流通性差,阻碍菌液渗入、菌丝生长,延长发酵周期,因此粒度控制为10目最为适宜。

图1 底物粉碎粒度对发酵周期的影响

2.1.2 培养基加水量对发酵周期的影响

如图2所示,培养基加水量的高低会显著影响灵芝菌的生长状态。加水量低时,不足以为菌的生长提供充足的水分;而加水量过高则会降低发酵基质中氧气的含量和空气的流通,导致发酵不充分及发酵周期过长。因此刺五加药材基质的加水量以40%最为适宜。

图2 基质加水量对发酵周期的影响

2.1.3 不同比例灵芝菌接种量对发酵周期的影响

如图3所示,接种量过少会增加发酵时间,而接种量过大则会引入更多水分含量,培养基的干湿平衡容易被破坏从而影响空气流通,干扰灵芝菌菌丝的生长,同时也会增大发酵成本。故接种量控制在灵芝菌丝体湿重∶刺五加固体培养基干重为2∶1时较为适宜,发酵完全所用时间较短。

图3 不同比例灵芝菌接种量对发酵周期的影响

2.1.4 不同生长因子加入对发酵周期的影响

如图4所示,当生长因子为CuSO4或MgCl2时,其二者对发酵周期的影响均较小,而当生长因子为MnCl2、NaCl、CaCl2时,可较大程度地缩短发酵时间,故选用MnCl2、NaCl、CaCl2作为发酵时添加的生长因子。

图4 不同生长因子对发酵周期的影响

Mn2+、Na+和Ca2+能够正向促进灵芝菌生长代谢,进一步通过单因素实验考察了不同摩尔浓度MnCl2、NaCl和CaCl2对灵芝菌固体发酵刺五加过程中生长周期的影响[28-31]。结果如图5所示,MnCl2和NaCl在10～40 mmol/kg区间内能够逐步降低灵芝菌的发酵周期,当二者浓度达到80 mmol/kg以上时,发酵速度显著降低,因此选择0～100 mmol/kg的区间进行响应曲面分析与优化;CaCl2的趋势与以上两种生长因子存在一定差异,在10～80 mmol/kg区间内能够逐步降低灵芝菌的发酵周期,而浓度达到160 mmol/kg以上后,发酵周期显著增加,因此选择30～150 mmol/kg的区间进行响应曲面分析与优化。

图5 不同生长因子浓度对发酵周期的影响

2.2 响应面优化刺五加-灵芝双向固体发酵工艺

2.2.1 Box-Behnken实验结果

单位发酵时间内,菌蕾干重的累积与微生物代谢药材基质的速度呈现正相关,可以用来表征发酵效率[32-33]。三萜作为灵芝主要功效物质,其含量会影响刺五加发酵产物的生物活性[34]。刺五加双向发酵的目的是为了开发具有潜在保健功效的健康产品原料,所以在工艺优化过程中分别考察了不同生长因子组合对这两项指标的影响。因此基于单因素考察结果,采用Box-Behnken中心组合实验设计(如表2所示),优化刺五加-灵芝双向固体发酵工艺。

表2 中心组合实验设计结果

2.2.2 响应面方差分析

通过Design-Expert12.0.3.0软件对Box-Behnken实验结果进行多元回归分析,得到下述两个回归方程。

Y1=0.85+0.055A+0.15B+0.12C+0.056AB+0.024AC-0.036BC-0.11A2-0.14B2-

(3)

Y2=22.08+0.61A+0.56B+2.14C+0.93AB-0.34AC+0.68BC-1.77A2-2.87B2-

(4)

式中:A、B、C分别为MnCl2、NaCl、CaCl2的添加量;Y1、Y2分别为灵芝菌蕾干重、菌蕾总三萜含量。

表3 菌蕾干重模型单因素方差分析结果

表4 菌蕾总三萜含量模型单因素方差分析结果

2.2.3 因素间交互作用分析及最佳工艺验证

利用Origin Pro软件处理得到3D响应面图和等高线图。当等高线为圆形时自变量对响应变量的影响无显著性,椭圆形或马鞍形的等高线代表自变量对响应变量有显著影响,交互作用的曲面坡度越大,其响应程度越高[39]。如图6所示,Mn2+与Na+的交互作用对菌蕾干重的影响最为显著,在0～80 mmol/kg范围内,随着Na+浓度的提高,菌蕾干重显著增加;其次为Na+与Ca2+的交互作用,而Mn2+与Ca2+的交互作用对菌蕾干重的影响不大。

图6 不同生长因子对灵芝菌蕾生物量的交互影响

菌蕾总三萜含量分析如图7所示,各因素交互作用对总三萜含量的影响趋势与菌蕾干重一致,同样为Mn2+与Na+>Na+与Ca2+>Mn2+与Ca2+。虽然在优化发酵工艺的过程中发现,菌蕾干重与总三萜含量最高点所对应的生长因子组合并没有完全重合,但是综合考虑发酵周期、菌质总得率以及各因素交互作用的相同趋势,最终以菌蕾干重作为主要指标对刺五加-灵芝双向发酵工艺进行优化和验证。

图7 不同生长因子对菌蕾总三萜含量的交互影响

以菌蕾总干重为主要响应值,通过软件得到刺五加-灵芝双向发酵体系中生长因子组成最优比例为:MnCl2(83.78 mmol/kg),NaCl(55.82 mmol/kg),CaCl2(148.964 mmol/kg),预测菌蕾总干重为0.934 g。将理论预测的最优发酵条件调整为MnCl2为84 mmol/kg、NaCl为56 mmol/kg、CaCl2为149 mmol/kg后通过3次实验进行验证,结果显示发酵后灵芝菌蕾的平均干重为0.920 4 g,标准偏差为0.12%,实测值和预测值之间具有较高拟合度,证明优化发酵条件具有实际应用价值。

2.3 刺五加-灵芝双向固体发酵产物的体外抗氧化活性评价

活性氧自由基是许多体内代谢过程的副产物,可以通过诱导氧化应激反应造成正常细胞的显著损伤,诱使加快衰老或产生其他相关疾病。大量文献证明,刺五加提取物具有有效的清除活性氧自由基能力,可明显提升抗氧化酶的活力,并可通过降低脂质过氧化程度从而减少由氧化应激引起的机体损伤[5,40-41]。目前,关于刺五加药材抗氧化作用的物质基础研究不够透彻,因此,无法跟踪在发酵过程中这些成分的变化情况,仅能比较发酵前后刺五加提取物的活性差异。为了客观评价刺五加-灵芝双向发酵之后的活性变化,采用同样的供试品制备方法分别从刺五加发酵产物、刺五加药材、灵芝药材和刺五加-灵芝混合物中获得提取物进行活力测定。通过图8可以看出,刺五加发酵产物、刺五加药材提取物、灵芝提取物以及刺五加-灵芝混合提取物均具有不同程度的抗氧化作用,该作用具有一定的剂量依赖性,随着样品浓度升高而增加(120～400 μg/mL)。其中,刺五加发酵产物对DPPH自由基清除率、SOD活性以及T-AOC的作用最强,其次为灵芝提取物、刺五加-灵芝混合提取物以及刺五加提取物,说明刺五加和灵芝二者双向发酵之后实现了协同增效的目的,推测其结果与发酵过程中产生新的物质基础有关[12]。

图8 刺五加发酵产物抗氧化活性评价结果

3 结论

通过研究发现了影响刺五加-灵芝双向固体发酵的主要影响因素及生长因子,进一步经过响应曲面优化之后,得到了最适的生长因子组合,极大的缩短了发酵周期,提高了刺五加发酵产物的生产效能,为发酵工艺的中试级别放大提供了有力的支撑。刺五加中主要的活性部位为刺五加苷类,包括酚苷和皂苷,据报道,这两类物质是刺五加发挥抗氧化活性的主要物质基础[42]。刺五加药用部位经过灵芝固体发酵之后,其抗氧化活性产生了显著的提高,推测原因主要有两点:一是刺五加苷的种类和组成发生了变化,形成了生物活性更强的分子效应团;二是刺五加发酵产物有机结合了灵芝自身的代谢产物,二者产生了协同增效作用。因此,后续的研究将主要集中于挖掘影响刺五加发酵产物抗氧化活性的物质基础,并从中筛选出能够表征刺五加-灵芝发酵产物质量的化学标志物,为保障双向发酵工艺的稳定性奠定基础。