落新妇苷的稳定性及生物活性研究进展

陈荷莹 刘 毅 刘会珍 陈佳倩 金 晨 黄慧莲

(江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室,南昌,330004)

落新妇苷具有“药食同源”性,存在于很多自然界植物和食物中,如黄杞[1]、土茯苓[2]、龟苓膏[3]、葡萄酒[4]等,具有选择性免疫抑制、抗氧化、抗肿瘤、保肝等多种生物活性。近年来,国内外科研人员对其进行了广泛研究,本文将从落新妇苷的化学结构、稳定性、纯化技术、药代动力学、生物活性等方面进行综述,为深入研究提供依据。

1 化学结构及其立体异构体

落新妇苷,即(2R,3R)-花旗松素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷,是1950年由Kozo Hayashi等首次从植物落新妇中提取得到的化合物[5]。它也是土茯苓中主要有效成分,被2020年版《中华人民共和国药典》列为含量测定指标。由于C-2、C-3的位置构型不同,它有4个立体异构体,分别是落新妇苷(2R,3R)、新落新妇苷(2S,3S)、新异落新妇苷(2S,3R)和异落新妇苷(2R,3S)。这4个立体异构体通常都同时存在植物中,能够通过中间体查尔酮相互转化,其中落新妇苷是主要成分[6-7]。

2 稳定性研究

黄酮类化合物通常有水溶性差、不稳定等特点。MAINI等[8]使用高效液相色谱法和紫外检测比较了高良姜素、山柰酚、槲皮素和杨梅素4种黄酮类化合物在培养基中通过紫外辐射后稳定性的大小,结果表明黄酮醇的稳定性会随着B环上取代基数目的增加而降低。ZHANG等[9]、付莹娟[10]也证实了这一结论:4′-羟基取代的B环的落新妇苷比3′,4′-二羟基取代的B环更稳定。落新妇苷及其立体异构体都不太稳定,容易受到外界温度、pH、金属离子等因素的影响。pH和温度能影响落新妇苷的异构化和降解反应,pH值和温度越高,异构化和降解速度越快。落新妇苷在pH值为4～5、温度为50 ℃以下的环境中比较稳定,在中性、弱碱性溶液中以异构化为主,分解速度较慢,当pH>10时,落新妇苷的分解速度变快[10-12]。当温度为25～40 ℃时,落新妇苷异构化成新异落新妇苷,异落新妇苷异构化成新落新妇苷;在60～80 ℃时,落新妇苷和新异落新妇苷都异构化为新落新妇苷[13]。

落新妇苷的稳定性会因其所溶解的溶剂不同而有差异,依次为50%乙醇>乙醇>甲醇>50%甲醇>水。它在不同的培养基中稳定性也不一样,依次为水>RPMI1640>高糖DMEM>低糖DMEM[10]。常见食品添加剂及金属离子也能影响落新妇苷稳定性:维生素C抗坏血酸和蔗糖可以抑制落新妇苷的分解,但是会促进其异构化;抗坏血酸对落新妇苷具有保护作用,但是也会加速其异构化;常用防腐剂苯甲酸钠无明显影响;Mg2+、Ca2+、Na+、K+等金属离子对落新妇苷有一定的增稳作用;Al3+可以完全抑制落新妇苷异构化,而对其分解没有任何影响;Cu2+、Zn2+、Fe3+能够加快落新妇苷分解,降低其稳定性,其中Fe3+特别明显[12,14]。

3 落新妇苷的纯化技术

高速逆流色谱(High-speed Counter-current Chromatography,HSCCC)是一种可行的分离黄酮类化合物的技术。FAN等[15]采用高速逆流色谱法,使用由正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶10∶1∶10,v/v/v)组成的两相溶剂体系,从菝葜提取物中纯化落新妇苷、新异落新妇苷,其纯度均大于98%。GUO等[16]提出了一种非传统的高速逆流色谱法,能够有效地从植物根茎中分离化合物。一种基于挤出模式的离线二维循环型高速逆流色谱(2D R-HSCCC)先将混合物收集于储存柱中,循环分离最后采集得到纯度大于96%的落新妇苷。WU等[17]建立了从土茯苓粗提物中分离和纯化的高效离心分配色谱(Centrifugal Partition Chromatograph,CPC)法,以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶10∶1∶10)作为两相溶剂系统,获得化合物纯度为98.5%。

4 药代动力学研究

落新妇苷在体内的代谢过程符合二室开放模型[18],具有水溶性差、口服吸收困难、生物利用度低的特点。研究人员给大鼠口服不同浓度的落新妇苷,采用液质色谱-串联质谱法(Liquid Chromatography-mass Spectroscopy/Mass Spectroscopy,LC-MS/MS)测定大鼠血浆和各种组织样品中落新妇苷的浓度,药代动力学结果显示12 mg/kg、24 mg/kg的落新妇苷给药大鼠后,化合物生物利用度分别为(1.16±0.695)%和(1.27±0.379)%,血浆半衰期分别为(101±35.8)min和(109±25.3)min[19]。聚维酮和吐温80结合使用可以显著改善落新妇苷的吸收能力,提高口服生物利用度[20-21]。用玉米蛋白-酪蛋白酸纳米颗粒包封落新妇苷可以提高化合物的口服生物利用度,用纳米颗粒制备的落新妇苷能够提高其稳定性[22]。ZHAO等[23]用超高液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用技术(Ultra Performance Liquid Chromatography-quadrupole/Time Of Flight-mass Spectrometry,UPLC-Q-TOF-MS)1中文错误,2给出英文和英文缩写分析落新妇苷在人体肠道细菌中的代谢物,检测到细菌样品中有槲皮素和圣草酚2种生物活性代谢物。

5 药理学与毒理学研究

5.1 选择性免疫抑制作用 正常的免疫反应是机体维持自我平衡和抵御外来入侵的主要机制,而过度的免疫反应则会引起各种自身免疫性疾病、过敏反应和炎症反应。免疫抑制药物通过抑制免疫反应来治疗相关疾病。然而免疫抑制治疗大都受限于缺乏抗原特异性,这通常导致整个免疫系统功能的普遍抑制和各种不良反应的发生[24-26]。落新妇苷具有独特的免疫抑制模式,可以选择性地消除参与某些特定疾病的淋巴细胞群而不降低机体的整体免疫活性,不同于环孢菌素A和其他免疫抑制剂。

落新妇苷能选择性抑制迟发型超敏反应的效应期而非诱导期,通过下调基质金属蛋白酶2(Matrix Metalloproteinase2,MMP2)和MMP-9的活性选择性抑制淋巴细胞功能,包括细胞迁移,从而抑制迟发型超敏反应相关的炎症[27]。它还能影响Th1/Th2细胞间的动态平衡,选择性地抑制活化的Th1细胞,而不影响Th2细胞。细胞因子的负调控也是选择性免疫抑制的重要机制。落新妇苷一方面通过抑制Th1细胞因子产生,上调白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)的下游蛋白、细胞因子信号传送阻抑物1(Suppressor of Cytokine Signaling,SOCS)1和SOCS3;另一方面减少肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)和γ-干扰素,在体内实现其接触性超敏反应的免疫调节功能[27-28]。与常用的免疫抑制剂环孢菌素A相比,落新妇苷能选择性抑制活化的T淋巴细胞,而对正常T淋巴细胞和其他免疫细胞无影响,不良反应较弱,更有益于治疗慢性免疫疾病。

此外,落新妇苷对树突状细胞(Dendritic Cell,DC)也有选择作用。它通过抑制DC的成熟和抗原呈递功能,阻止T细胞活化,从而抑制心脏同种异体移植物排斥反应。当落新妇苷与环孢菌素A共同给药时,显著延长了移植物的存活率,且呈剂量依赖性[29]。DING等[30]报道了落新妇苷能诱导结肠炎小鼠DC中转化生长因子β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)和IL-10的产生,在DC中内源性TGF-β的产生促进了CD4+、CD25+、叉头框蛋白P(Forkhead Box P,Foxp)3+调节性T细胞的诱导以及CD103+的表达,同时它还抑制DC分泌IL-1β、IL-12 p40和CD86+。因此,落新妇苷可以作为候选药物通过诱导DC介导其调节功能来治疗炎症性肠病和其他炎症性疾病,如多发性硬化、牛皮癣和类风湿性关节炎等[31]。

5.2 抗氧化作用 类黄酮是一种广泛存在于水果和蔬菜中的重要化合物。它们具有在体内螯合过渡金属离子、清除自由基和诱导抗氧化酶的能力。因此,大多数类黄酮化合物都是有效的天然抗氧化剂。落新妇苷能有效清除2,2-二苯基-1-吡啶并肼基(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl Radical,DPPH)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐[2,2′-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate),ABTS]和超氧阴离子的自由基,抑制亚油酸过氧化。其效果与合成抗氧化剂如丁基羟基茴香醚(Butyl hydroxyanisole,BHA)和2,6-二叔丁基对甲酚(Butylated hydroxytoluene,BHT)相当[32]。落新妇苷能抑制超氧阴离子的生成,抑制细胞色素P450还原酶诱导的微粒体脂质过氧化,保护红细胞免受氧化溶血[33]。PETACCI等[34]报道落新妇苷以浓度依赖性关系抑制髓过氧化物酶和辣根过氧化物酶活性,并有效清除次氯酸。类黄酮环中的取代模式可以增加或降低抗氧化活性,落新妇苷B环中的3′,4′-邻二羟基构型和C环中的4-羰基具有自由基清除活性。ZHANG等[35]利用落新妇苷的抗氧化作用来研究其对镉毒性的拮抗作用,结果表明它可以通过氧化应激缓解镉诱导的鲤鱼头肾淋巴细胞的凋亡。

5.3 抗炎作用 炎症反应是机体一种重要的免疫防御机制。巨噬细胞是一种重要的免疫细胞,可参与调节炎症反应过程。脂多糖通过细胞信号转导系统激活巨噬细胞进入炎症状态,增加炎症介质mRNA的表达,从而导致多种炎症介质的产生。HUANG等[36]研究发现落新妇苷对脂多糖刺激的小鼠巨噬细胞中Toll样受体(Toll-like Receptor,TLR)、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、单核细胞趋化蛋白1和环氧化酶-2具有抑制作用。它还可以显著抑制一氧化氮和TNF-α的产生,以及诱导型一氧化氮合酶和TNF-α的mRNA表达,这些作用可能与p65、细胞外信号调节激酶1/2和c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal Kinase)通路有关[37]。落新妇苷能抑制急性肺损伤大鼠的支气管肺泡中炎症介质、趋化因子的产生及巨噬细胞抑制因子的表达,从而抑制炎症反应[38-39]。此外,落新妇苷还可以抑制胶原蛋白-Ⅰ和胶原蛋白-Ⅲ的表达,降低了炎症介质TNF-α、IL-1β、IL-6的表达,有效改善四氯化碳诱导的肝损伤[40]。

Th17细胞在银屑病的发病机制中发挥重要作用[41-42]。银屑病俗称牛皮癣,是免疫介导的炎症性皮肤病,其发病与炎症细胞浸润和炎症介质有关[43]。落新妇苷可以通过抑制Th17相关的炎症反应来减轻牛皮癣样皮肤损伤。落新妇苷可以改善咪喹莫特诱导的角质形成细胞增殖,减少CD3+细胞向牛皮癣病变组织的浸润,并改善循环CD4+和CD8+T细胞和炎症介质(IL-17A,TNF-α,IL-6,IFN-γ和IL-2)的升高。在体外,落新妇苷抑制Th17细胞分化、IL-17分泌和Jak/Stat3信号转导,同时上调牛皮癣病变中信号转导及转录激活因子(Signal Transduction and Activator of Transcription,STAT)3抑制剂SCOSE3的表达[44-45]。

在类风湿关节炎小鼠模型中,落新妇苷和低剂量氨甲蝶呤(Methotrexate,MTX)的联合使用,会显著抑制血清中的抗体(IgG,IgG1,IgG2a,IgM和抗胶原IgG)和炎症介质(IL-1β,IL-6,TNF-α,IFN-γ和IL-17A)的表达[46]。宋伟等[47]为了探讨落新妇苷抗骨关节炎作用机制,运用网络药理学预测落新妇苷可能直接作用于STAT1、STAT3、RAS等靶点,通过影响AGE/RAGE信号通路,抑制TNF-α表达促进CCND1的表达,进而促进软骨细胞的增殖和抑制炎症介质的产生。李中华等[48]也通过实验证实落新妇苷可以有效缓解骨关节炎症状,其原因可能与抗炎和软骨机制降解有关。

NAKAHARA等[49]证实落新妇苷不仅可以增加Caco-2细胞的跨上皮电阻值、密封蛋白-1和紧密连接蛋白-2的mRNA表达水平以及密封蛋白-1和紧密连接蛋白-2的蛋白质表达水平,而且还上调了与TNF-α加γ干扰素共同处理的Caco-2细胞中紧密连接蛋白的表达。其结果表明落新妇苷可以增强紧密连接蛋白的表达,导致肠细胞中屏障功能的上调,有效改善结肠炎。RAO等[50]研究发现落新妇苷作为膳食补充剂能够抑制脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠模仿外周感染的神经炎症。落新妇苷能有效减少LPS诱导小鼠的炎症标志物,同时抑制TLR-4和脑源性神经营养因子(Brain-derived Neurotrophic Factor,BDNF)表达,在预防老年人群急性精神障碍方面拥有巨大的发展潜力。

5.4 降血糖、血脂作用 晚期糖基化终末产物(Advanced Glycation End Products,AGEs)是过量的糖和蛋白质结合的产物,能够加速人体的衰老,引起各种慢性退化性疾病,比如糖尿病。落新妇苷能抑制AGEs的形成,其作用与槲皮素相同[51]。NGUYEN等[52]发现土茯苓乙酸乙酯提取物对体内2型糖尿病模型的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶表现出较强的抑制活性,可显著降低糖尿病小鼠的血糖,并对肝脏无损害作用。糖尿病肾病是糖尿病患者最重要的并发症之一。落新妇苷可以抑制高糖刺激的HK-2细胞产生TNF-β1和结缔组织生长因子,以及通过PI3K/AKT通路减弱高浓度葡萄糖诱导的HK-2细胞自噬和凋亡来改善糖尿病肾病临床病症[53]。

落新妇苷可以通过激活AMP活化蛋白激酶(AMP-activated Protein Kinase,AMPK)来抑制脂质积累。激活的AMPK不仅可以通过抑制脂肪酸合成酶的活性来降低脂质的生物合成,而且还可以提高脂肪三酰甘油脂肪酶的表达,增加激素敏感脂肪酶的磷酸化,从而促进脂解[54]。落新妇苷还能够降低黏菌与拟杆菌的比例,通过增加有益细菌并减少有害细菌来改善高脂肪饮食小鼠诱导的肠道微生物生态失调,从而增强肠道碳水化合物和脂质代谢[55]。赵磊等[56]也证实了土茯苓中的类黄酮提取物能够缓解肝细胞的变性程度,调节肠道中短链脂肪酸的含量,逆转高脂肪饮食诱导的大鼠的肠道生态失调。

5.5 抗肿瘤作用 WANG等[57]利用落新妇苷在人前列腺癌细胞中测试发现,落新妇苷具有潜在的抗增殖作用。其抗增殖的作用机制可能是对几种信号通路的影响的组合,包括炎症性核因子κB(Nuclear Factor-κB,NF-κB)信号通路和一些增殖通路。落新妇苷对乳腺癌细胞也表现出抗增殖作用和促凋亡作用[58]。SA等[59]发现落新妇苷能够通过激活线粒体和半胱天冬酶来诱导肝癌细胞系HepG2和Hep3B细胞凋亡,对肝癌的发生具有潜在的保护作用。

5.6 抗血管疾病作用 研究发现,巴西特有物种古柯属植物的提取物落新妇苷会显著抑制血管紧张素转化酶,其活性与卡托普利没有差异,具有潜在的抗高血压作用[60]。落新妇苷可以改善糖尿病大鼠免受心肌缺血再灌注损伤,减少梗死面积,改善血流动力学,减轻心肌损伤,这些作用与糖尿病大鼠缺血心肌组织中炎症介质血清水平、高迁移率族蛋白B1、磷酸化核因子κB的降低相关。落新妇苷还可以直接刺激心脏血流动力学并抑制心肌细胞坏死[61]。ZHAO等[62]报道了落新妇苷通过抑制平滑肌增殖,可以有效地防止同种异体移植中动脉硬化的发生。另有研究报道落新妇苷的一些衍生物具有显著的抗伤害性和抗生血管性质,但如果其衍生物连有糖、羟基和乙酰基等极性基团存在时则会降低镇痛活性[63]。

5.7 落新妇苷的细胞毒性检验 GAO等[64]研究发现口服不同剂量落新妇苷的大鼠与对照组的毒性差异无统计学意义,未观察到不良反应,各项指标参数正常,用Ames试验、染色体畸变试验和哺乳动物微核试验评估了落新妇苷的遗传毒性,其结果显示测试菌株都没有遗传毒性。该项研究结果表明,落新妇苷可以安全应用,为开发天然药物、功能性食品或食品添加剂提供了可能,为未来的临床研究提供了重要保障。

6 总结

落新妇苷是二氢黄酮醇苷类化合物,具有抗炎、抗肿瘤、抗心血管疾病等多种生物活性,具有广泛的临床应用前景。本文全面系统地总结了落新妇苷的活性成分研究并且首次对影响落新妇苷稳定性因素进行归纳概括,为日后新药研发提供更多的参考依据。近年来,落新妇苷具有选择性免疫抑制作用并且无口服毒性和遗传毒性,这一天然优势引起了科研人员的高度关注,可能有望研发出新的免疫抑制药物。

目前,有关落新妇苷的研究多集中于细胞实验或动物实验,临床研究薄弱,再加上落新妇苷具有水溶性差、生物利用度低的特点,尚未开发出相关药物,使其不能很好发挥药用价值。开发纳米新剂型或选择其他合适溶剂溶解或许是临床研究的新方向。

利益冲突声明:无。