茉莉酸甲酯和水杨酸对膜荚黄芪芒柄花苷积累的影响

姜 雯, 孙 博, 祝显强, 吴松权, 全雪丽

(延边大学 农学院,吉林 延吉 133002)

膜荚黄芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.)为豆科黄芪属多年生草本植物。黄芪在我国主要分布在内蒙古、吉林、山西、甘肃、宁夏等省区[1]。黄芪中主要含有多糖、皂苷和黄酮3大类活性成分,具有增强免疫功能[2]、抗氧化、抗压、保肝等多种功效,针对高血压、脏器缺血[3]、肾病、糖尿病[4]均有较高的疗效,临床治疗价值显著。膜荚黄芪作为一种药食同源植物,以野生为主,但由于近年来过度采挖,致使野生膜荚黄芪资源几近枯竭,不能满足人们的需求[5]。

植物细胞培养具有巨大的产生特定次级代谢产物的潜力[6],次生代谢产物是植物对抗外界胁迫的重要手段[7]。不定根培养是植物组织培养技术之一,可人为调控植物的生长环境,避免病虫害的侵袭,缩短栽培植物的生长周期,且具有良好的遗传稳定性,所合成的有效化学成分可用于生产护肤品、药物、食品添加剂等[8]。影响次生代谢产物含量的因素很多,如激素的种类配比和浓度[9],田文等[10]在东北刺人参不定根中添加SA提高了黄酮类和蒽醌类产物的积累;高彦云等[11]发现液体培养体系中0.05 mmol/L正己醛能促进黄芪不定根合成皂苷类物质等。

芒柄花苷为黄芪中黄酮类化合物的代表性成分,具有促进皮肤生长、清除氧自由基、抑制脂质过氧化、维持血中NO浓度和保护缺血再灌注损伤、增强免疫等多种药理活性[12]。茉莉酸甲酯(MeJA)和水杨酸(SA)常作为诱导子来提高药用植物不定根中次生代谢物的含量。为提高膜荚黄芪不定根中芒柄花苷的含量,该研究以膜荚黄芪不定根为材料,研究了MeJA和SA对芒柄花苷积累的影响,为规模化生产芒柄花苷提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

参照Jin等[13]的方法,选择生长健壮的膜荚黄芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.)不定根接至B5液体培养基中,培养32 d后进行继代培养。

1.2 方法

1.2.1 MeJA处理

在无菌环境下向培养40 d的黄芪不定根中分别加入0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mmol/L的MeJA,暗室振荡培养5 d后进行取样;选择最佳浓度的MeJA加到培养至0、8、16、24、32、40 d的黄芪不定根中,暗室振荡培养,第45天时统一取样;依据结果在不定根继代培养的最佳天数时加入0.2 mmol/L MeJA处理,分别培养2、4、6、8、10 d后取样。

1.2.2 SA处理

同1.2.1.

1.2.3 协同处理

依据上述结果,在MeJA处理的最佳条件下分别加入0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mmol/L的SA,暗室振荡培养5 d后取样。以上试验均设置3次重复,将取出的样品烘干后用于干重、芒柄花苷含量及产量的测定。

1.3 检测方法

不定根干重测定:样品采收后,用自来水反复冲洗3次,去除不定根表面残留的培养液糖分后,用吸水纸将多余水分吸干并在50 ℃烘干箱中干燥48 h,待重量稳定后测量干重。

参照李子羊等[14]的方法提取芒柄花苷,根据HPLC分析出的数据带入芒柄花苷标准曲线计算得出芒柄花苷含量,产量公式如下:

芒柄花苷产量/(mg·瓶-1)=干重/(g·瓶-1)×芒柄花苷含量/(mg·g-1)

1.4 数据分析

使用IBM SPSS 20.0对试验数据进行分析,采用Duncan新复极差法(P<0.05)进行多重比较,利用Graphpad Prism 5.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 MeJA处理对芒柄花苷积累的影响

2.1.1 MeJA浓度对芒柄花苷积累的影响

添加5个浓度MeJA观察其对芒柄花苷积累的影响(图1),仅在0.4 mmol/L时显著降低了不定根的干重,与对照相比减少了40%(图1-A);过低的MeJA浓度(0.05 mmol/L)对芒柄花苷的含量没有显著影响,随着浓度升高,在浓度为0.2 mmol/L时芒柄花苷含量达到最高,为0.308 mg/g,是对照含量的314%,之后增加MeJA浓度,芒柄花苷的含量有所下降,但仍然显著高于对照(图1-B)。MeJA浓度对芒柄花苷产量的影响与含量的变化相同,呈先升高后下降趋势,当MeJA浓度为0.2 mmol/L时,芒柄花苷的产量达到最高(图1-C),为0.159 mg/瓶。

图1 MeJA浓度对芒柄花苷积累的影响

2.1.2 MeJA添加时期对芒柄花苷积累的影响

不定根生长至0、8、16、24、32、40 d时分别加入0.2 mmol/L MeJA。MeJA抑制了不定根的生长,并且这种抑制作用随不定根生长时期的增加逐渐减弱,至32 d时完全减弱,基本与对照持平(图2-A);不定根生长的任一时期外施MeJA对芒柄花苷的积累均有显著的促进作用,且随着生长时期的增加芒柄花苷的含量呈先上升后下降趋势,当不定根生长到第32天时,添加芒柄花苷的含量达到最高(图2-B),为0.429 mg/g;在黄芪不定根生长的中后期施加MeJA能有效提高芒柄花苷产量,在第32天施加MeJA诱导的芒柄花苷产量达到最高(图2-C),为0.225 mg/瓶。

图2 MeJA添加时期对芒柄花苷积累的影响

2.1.3 MeJA处理时间对芒柄花苷积累的影响

与对照组相比,MeJA处理2、4、6、8、10 d时均显著提高了芒柄花苷含量(图3)。芒柄花苷含量随处理时间的增加呈先上升后下降的趋势,当处理时间为6 d时,芒柄花苷含量达到最高,为0.595 mg/g,比对照增加了540%。

2.2 SA处理对芒柄花苷积累的影响

5种浓度的SA处理对干重(图4-A)、芒柄花苷含量(图4-B)均无显著差异,说明SA处理对芒柄花苷的积累无作用。

图4 不同浓度SA对芒柄花苷积累的影响

2.3 SA与MeJA协同处理对芒柄花苷积累的影响

在培养32 d的不定根中加入0.2 mmol/L MeJA和0～0.4 mmol/L SA时,只有中浓度(0.1～0.3 mmol/L)SA才能促进芒柄花苷的积累,并且SA浓度在0.1和0.2 mmol/L时芒柄花苷的含量达到最高(图5),为0.812 mg/g,与对照(MeJA单独处理)相比芒柄花苷含量增加了39%。

图5 SA对MeJA诱导的芒柄花苷积累的影响

3 讨论与结论

膜荚黄芪不定根培养是获取芒柄花苷的可行途径之一,但是其含量较低[15]。MeJA不仅诱导了黄芩苷的含量[16],还使总异黄酮含量增加[17]。由MeJA浓度对芒柄花苷积累的影响(图1-B)可知,MeJA也具有显著提高芒柄花苷含量的作用,其中,添加0.2 mmol/L MeJA时黄芪不定根中芒柄花苷的含量最多,而过高浓度的MeJA会影响芒柄花苷的积累,这可能是与高浓度的MeJA引起了氧化胁迫,抑制细胞生长有关[18]。有研究表明,在龙眼胚性悬浮细胞添加0.05 mmol/L MeJA时柯里拉京含量达到最高[19];在香菇菌板添加0.01 mmol/L MeJA时多糖积累量达到最高[20],说明不同次生代谢产物积累所需的MeJA浓度有所不同。

MeJA诱导次生代谢产物积累量也受到材料本身状态和诱导时长的影响。晏小霞等[21]的研究结果表明,姜黄素在姜黄种植190 d喷施MeJA时的积累达到最高;类黄酮和胡萝卜素在苋菜悬浮细胞培养第4天时添加MeJA,其含量达到最高[22]。此外,管桐等[23]报道,MeJA处理3 d后红景天苷的含量和生产量达到最大值;采用土培法种植颠茄实生苗时,MeJA处理28 d后莨菪碱和东莨菪碱含量达到最高[24]。说明MeJA的添加时期和处理时间对次生代谢物的积累产生重要影响。该研究结果表明,利用0.2 mmol/L MeJA处理黄芪不定根时,芒柄花苷积累达到最佳时的添加时期和处理时间分别为培养32 d(图2)和处理6 d(图3)。

SA对黄芪不定根中芒柄花苷的积累无显著直接促进作用(图4)。但中浓度的SA(0.1～0.3 mmol/L)却促进了MeJA诱导的芒柄花苷积累的影响(图5)。类似地,一定浓度的SA也分别促进了MeJA诱导的假马齿苋芽苦艾素A的积累[25]和MeJA诱导的颠茄莨菪碱与东莨菪碱的积累[26]。可以推测SA通过与MeJA协同作用提高了黄芪不定根中芒柄花苷的积累,该试验的最佳处理为培养32 d的不定根中加入0.2 mmol/L MeJA+0.1 mmol/L SA后处理6 d,芒柄花苷的含量与未处理的对照相比含量提高了726%。