融合文献挖掘及生信分析探讨围绝经期综合征的用药规律及作用机制

贾慧雨，冯志海，吕娜，冯文帅，靳鸽，闫丰喆，王淑倩（.河南中医药大学，河南 郑州 00；. 河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 0000；.河南省中医药研究院附属医院，河南 郑州 000；.天津中医药大学，天津 07；.北京中医药大学，北京 0009；.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 70000）

围绝经期综合征（PMS）是指女性绝经前后由于卵巢功能减退、雌激素水平波动或下降而出现的一系列躯体或精神症状，如失眠多梦、急躁易怒等，严重影响患者日常生活及身心健康[1]。据调查[2-5]，约80%围绝经期妇女患有不同程度的PMS，同时PMS患者并发心血管疾病、骨质疏松症及抑郁症的风险也均高于健康女性。目前，现代医学治疗PMS 以雌激素替代疗法为主，虽疗效确切，但长期治疗后肥胖、痴呆、乳腺癌及心血管疾病等发生风险均随之升高[6]；另外，受传统观念影响，不少患者对激素的认识存在误区，接受度不高，使雌激素疗法的应用受到限制。近年来，安全性更高、副作用更小的中医药治疗在PMS 防治中受到关注，除单味中药外，许多经典方剂被临床研究及药理实验证实具有雌激素样作用。中药复方多成分、多靶点的特点使之具有独特优势，可有效缓解PMS 临床症状，调节患者体内激素水平[7]，但目前尚缺乏归纳分析其用药规律及作用机制的研究。因此，本研究拟基于文献数据库挖掘具有确切临床疗效的PMS 中药复方，归纳总结其用药规律，并进一步采用网络药理学方法分析核心处方的作用机制，以期为PMS 的临床辨证施治及后续研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 基于文献数据挖掘的PMS 用药规律分析

1.1.1 处方来源 以（“围绝经期综合征”OR“更年期综合征”OR“绝经前后诸证”）AND“中医药”为检索式，在线检索收录于中国知网（https://cnki.net）、万方医学网（https://med.wanfangdata.com.cn）及维普网（http://www.cqvip.com）的中医药治疗PMS 的相关文献；并以（“perimenopausal syndrome” OR “menopause syndrome” OR “perimenopause syndrome”）AND“traditional Chinese medicine”为检索式，在PubMed数据库（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov）检索文献进行补充，检索时间范围均为建库至今。

1.1.2 纳入标准 ①中药复方治疗PMS 的临床研究类文献；②文献中方药组成完整，含随证加减的方药仅录入基本方，基本方完全相同的文献仅录入一次；③疗效确切，无明显不良反应。

1.1.3 排除标准 ①综述、医案、理论探讨及基础实验等非临床研究类文献；②重复发表的文献；③方药组成不明或仅研究单味药的文献。

1.1.4 数据库建立及规范化处理 采用Excle 2019 软件，通过双人双输入、第三人校验的方式录入按照纳入排除标准筛选出的文献处方，建立中药复方数据库。以2020 年版《中华人民共和国药典》[8]为标准，对中药名称进行规范化处理，如将“龟板”规范为“龟甲”，“夜交藤”规范为“首乌藤”；炮制前后功效差异明显的不作统一，如将“生地”“生地黄”统一规范为“地黄”，而“熟地黄”不作统一。2020 年版《中华人民共和国药典》未收录的中药参考《中华本草》[9]进行规范。

1.1.5 数据分析 ①运用Excle 2019 软件对药物进行频次分析，并依据2020 年版《中华人民共和国药典》[8]、第9 版《中药学》[10]统计分析药物的性味归经及类别；②运用IBM SPSS Modeler 18.0 软件对高频药物进行关联规则分析后，将结果导入Cytoscape 3.7.2 软件，借助CytoNCA 插件筛选度中心性（DC）、中介中心性（BC）、接近中心性（CC）均大于中位数的核心药物，进一步基于Apriori 算法对其进行关联规则分析；③运用IBM SPSS Statistics 26 软件对核心药物进行系统聚类分析，归纳总结中药治疗PMS 的常用组合。

1.2 核心处方治疗PMS 作用机制的生信分析

1.2.1 核心处方活性成分筛选及其靶点获取 基于文献数据挖掘分析结果及PMS 病机特点，确定中药治疗PMS 的核心处方。利用中药高通量实验和参考数据库——本草组鉴（HERB，http://herb.ac.cn）[11]获取核心处方的活性成分及其作用靶点，并将口服生物利用度（OB）＜30%的成分剔除后，进一步借助SwissTargetPrediction 平台（http://swisstargetprediction.ch）[12]，根据药物吸收、分布、代谢和排泄（ADME）筛选出胃肠吸收度为“高”且类药性5 项条目中至少满足2 项的活性成分[13]。

1.2.2 PMS 疾病相关靶点获取 通过OMIM 数据库（https://www.omim.org）[14]、GeneCards 数据库（https://www.genecards.org）[15]， 分 别 以 “perimenopausal syndrome”“menopause syndrome”“perimenopause syndrome”为检索词，获取PMS 疾病相关靶点，并剔除重复部分。

1.2.3 核心处方治疗PMS 的“活性成分-潜在作用靶点”网络构建 利用Excle 2019 软件对核心处方活性成分作用靶点与PMS 疾病相关靶点取交集，得到核心处方治疗PMS 的潜在作用靶点。将潜在作用靶点与“核心处方活性成分-作用靶点”进行映射，得到核心处方治疗PMS 的活性成分。利用Cytoscape 3.7.2 软件构建核心处方治疗PMS 的“活性成分-潜在作用靶点”网络，并进行拓扑分析，根据度值（Degree）筛选出关键活性成分。

1.2.4 潜在作用靶点KEGG 通路富集分析 基于Metascape 数据库（https://metascape.org）[16]对核心处方治疗PMS 的潜在作用靶点进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，设置物种为人类，筛选条件为P＜0.01。

1.2.5 核心处方治疗PMS 的关键靶点筛选 运用STRING 平台（https://cn.string-db.org）[17]构建核心处方治疗PMS 的潜在作用靶点的蛋白相互作用（PPI）网络，隐藏游离节点，设置置信度=0.7。将PPI 结果导入Cytoscape 3.7.2 软件，基于CytoHubba 插件分别使用最大集团中心性（MCC）、Degree、最大邻域分量（MNC）、辐射度（Radiality）、边缘渗透组件（EPC）等参数进行拓扑分析。以上5 种算法均为从PPI 网络筛选核心蛋白的可靠方法[18-19]，为增加筛选可靠性，对每种算法结果排前20 位的靶点取交集，作为核心处方治疗PMS 的关键靶点。

1.2.6 分子对接 通过PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）获取Degree 值排前6 位的关键活性成分的结构；通过PDB 数据库（https://www.rcsb.org）下载用于分子对接的目标靶点（核心处方治疗PMS 的7 个关键靶点及卵巢类固醇生成通路所富集的11 个潜在靶点）晶体结构；使用AutoDock Vina软件进行分子对接，计算关键活性成分与目标靶点的结合能，以预测其结合活性。结合能为负值表明二者可自发结合，结合能越小结合活性越强，相互作用越稳定[20]。使用Pymol 软件计算对接前后配体小分子的均方根偏差（RMSD）以评估分子对接可靠性，当RMSD ≤2.0 Å 时，可认为对接模型设置合理[21]。

2 结果

2.1 中医药治疗PMS 的用药规律分析

2.1.1 用药频次分析 结果初步检索得到2 154 篇文献，其中按照纳入、排除标准筛选出的文献共256 篇，涉及处方291 个，中药181 味。用药频次总计3 355 次，其中高频药物（频次≥15 次）52 味，排前5 位的分别为山茱萸（149 次，51.20%）、熟地黄（142 次，48.80%）、白芍（129 次，44.33%）、当归（129 次，44.33%）、茯苓（127 次，43.64%），结果见表1。用药涵盖16 种中药类别，其中补虚药使用频率最高（1 528 次，45.54%）、清热药（489 次，14.58%）次之，结果见图1。性味归经分析显示，药性以平为主（905 次，26.97%），其次为寒（605 次，18.03%）；药味以甘为主（2 251 次，41.18%），其次为苦（1 009 次，18.46%）；主要归肝经（2 131 次，23.58%）、肾经（1 978 次，21.88%），结果见图2。

图1 中医药治疗围绝经期综合征的药物类别统计Figure 1 Categories and frequencies of traditional Chinese medicine in treating perimenopausal syndrome

图2 中医药治疗围绝经期综合征的药物性味归经雷达图Figure 2 The radar charts of properties，flavors and meridian tropisms of traditional Chinese medicine in treating perimenopausal syndrome

2.1.2 核心药物关联规则分析 将高频药物关联结果导入Cytoscape 3.7.2 软件，借助CytoNCA 插件筛选出核心药物共26 味，结果见图3。将核心药物关联复杂网络进行可视化升级（见图4），并基于Apriori算法对其进一步分析，设置最大前项数=2、最低条件支持度=10.0%、最小规则置信度=70.0%。结果筛选出二项关联共14 条，支持度最高的为山茱萸-熟地黄，结果见图5；筛选出三项关联共68 条，支持度最高的为熟地黄-山药-山茱萸，结果见表2。二项与三项关联提升度均＞1，提示前项与后项具有较高的正相关性。

图3 中医药治疗围绝经期综合征的核心药物筛选过程图Figure 3 The screening process diagram of core traditional Chinese medicine in treating perimenopausal syndrome

图4 中医药治疗围绝经期综合征的核心药物关联规则复杂网络Figure 4 The complex network of association rules of core traditional Chinese medicine in treating perimenopausal syndrome

图5 中医药治疗围绝经期综合征的核心药物二项关联可视化结果Figure 5The binomial association visualization of core traditional Chinese medicine in treating perimenopausal syndrome

表2 中医药治疗围绝经期综合征的核心药物三项关联分析结果（前20 条）Table 2 The results of three association analyses of core traditional Chinese medicine in treating perimenopausal syndrome（top 20）

2.1.3 核心药物聚类分析 使用IBM SPSS Statistics 26 软件基于组间联接法对核心药物进行系统聚类分析，度量标准区间选择Pearson 相关性，结合PMS 临床辨证论治实际情况进行分析，结果见图6。截距为23，共聚类为7 个组最为合适，即组合1：牡蛎、龙骨、小麦、酸枣仁；组合2：丹参、川芎、白芍、柴胡、当归；组合3：甘草；组合4：五味子、麦冬、黄芪；组合5：淫羊藿、仙茅、知母、菟丝子；组合6：山茱萸、山药、熟地黄、牡丹皮、泽泻、茯苓；组合7：女贞子、墨旱莲、地黄。

图6 中医药治疗围绝经期综合征的核心药物系统聚类谱系图Figure 6 The pedigree diagram of hierarchical clustering of core traditional Chinese medicine in treating perimenopausal syndrome

2.2 核心处方治疗PMS 的作用机制分析

2.2.1 核心处方活性成分及其作用靶点 基于数据挖掘各项结果及PMS 病机特点分析，确定聚类分析结果中的组合6（山茱萸、山药、熟地黄、牡丹皮、泽泻、茯苓）为中药治疗PMS 的核心处方。通过HERB数据库获取核心处方活性成分及其作用靶点，并经SwissTargetPrediction 平台根据ADME 参数进行筛选后，共获得山茱萸活性成分132 种、山药64 种、熟地黄23 种、牡丹皮45 种、泽泻31 种、茯苓35 种；获得山茱萸活性成分作用靶点1 047 个、山药461 个、熟地黄265 个、牡丹皮519 个、泽泻24 个、茯苓346 个，经整合去重后共得到核心处方活性成分作用靶点1 191 个。

2.2.2 核心处方治疗PMS 的潜在作用靶点 通过OMIM 数据库共获取得到PMS 疾病相关靶点641 个，通过GeneCards 数据库选取相关分数大于中位数的PMS 疾病相关靶点856 个，对二者整合去重后共获取疾病相关靶点1 447 个。将药物活性成分作用靶点与疾病相关靶点取交集，共得到238 个交集靶点，即核心处方治疗PMS 的潜在作用靶点。

2.2.3 核心处方治疗PMS 的“活性成分-潜在作用靶点”网络构建 将潜在作用靶点与“核心处方活性成分-作用靶点”映射，共获得核心处方治疗PMS 的活性成分139 种，涉及山茱萸活性成分72 种、山药33 种、熟地黄9 种、牡丹皮23 种、泽泻13 种、茯苓9 种。借助Cytoscape 3.7.2 软件构建核心处方治疗PMS 的“活性成分-潜在作用靶点”网络（见图7），网络节点大小、颜色深浅与Degree 值正相关，Degree 值排前6 位的关键活性成分为姜黄素、槲皮素、姜黄油树脂、辣椒素e、3-二苯并呋喃磺酸、丁香酚。

2.2.4 潜在作用靶点的KEGG 通路富集分析 结果见图8。KEGG 通路富集分析结果显示，核心处方治疗PMS 的潜在作用靶点主要富集在癌症通路（Pathways in cancer）、 磷脂酰肌醇3- 激酶/蛋白激酶B（Phosphoinositide3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信号通路、库欣综合征（Cushing syndrome）、河马信号通路（Hippo signaling pathway）、卵巢类固醇生成（Ovarian steroidogenesis）等20 条信号通路。其中，卵巢类固醇通路（共富集11 个潜在作用靶点）中卵巢膜细胞与颗粒细胞协同作用以产生类固醇激素，对维持女性子宫功能及卵巢生理功能至关重要，故预测其为核心处方治疗PMS 的关键通路。

图8 核心处方治疗围绝经期综合征的潜在作用靶点KEGG通路富集分析Figure 8 KEGG pathway enrichment analysis of potential targets of core prescription in treating perimenopausal syndrome

2.2.5 核心处方治疗PMS 的关键靶点筛选 运用STRING 平台构建潜在作用靶点PPI 网络，将结果导入Cytoscape3.7.2 软件后分别选取5 种拓扑算法中排前20 位的靶点（见图9），对其取交集后获得7 个关键靶点（见图10），即STAT3、TP53、IL6、TNF、CTNNB1、EGFR、IL1B。

图9 核心处方治疗围绝经期综合征的5 种拓扑算法中排前20 位的潜在作用靶点Figure 9 The top 20 potential targets of the five topological algorithms of core prescription in treating perimenopausal syndrome

图10 核心处方治疗围绝经期综合征的关键靶点韦恩图Figure 10 The Venn diagram of key targets of core prescription in treating perimenopausal syndrome

2.2.6 分子对接验证 将7 个核心处方治疗PMS 的关键靶点及卵巢类固醇生成通路所富集的11 个潜在靶点作为目标靶点， 与关键活性成分姜黄素（curcumin）、槲皮素（quercetin）、姜黄油树脂（79%～85%姜黄素，curcumine）、辣椒素e[capsaicin（e）]、3-二苯并呋喃磺酸（3-dibenzofuransulfonic acid）、丁香酚（eugenol）进行分子对接，结果见图11。结果表明，关键活性成分与目标靶点均可自发结合，52.78%的对接结构具有良好的结合活性（结合能＜-5.0 kcal·mol-1），31.48%的对接结构具有强烈的结合活性（结合能＜-7.0 kcal·mol-1）。进一步计算小分子RMSD 值，结果表明75.92%的对接模型具有可靠性（见表3），其中槲皮素与各目标靶点的对接及INSR、CYP17A1、CYP11A1、STAT3、EGFR 与各关键活性成分的对接结合能均＜-5.0 kcal·mol-1，RMSD 值均＜2 Å。提示槲皮素可能为核心处方治疗PMS 的核心成分，INSR、CYP17A1、CYP11A1、STAT3、EGFR 可能为核心靶点。

图11 核心处方治疗围绝经期综合征的关键活性成分与目标靶点分子对接结合能热图Figure 11 The heat map of molecular docking binding energy of main effective components and targets of core prescription in treating perimenopausal syndrome

表3 核心处方治疗围绝经期综合征的关键活性成分与目标靶点分子对接后配体小分子的RMSD 值（Å）Table 3 The RMSD value of ligand small molecules after molecular docking of main effective components and targets of core prescription in treating perimenopausal syndrome（Å）

3 讨论

围绝经期综合征（PMS）属中医“绝经前后诸证”范畴，主要病机为肾脏阴阳失调，涉及心、肝、脾等[22]。国医大师班秀文[23]指出，PMS 发病总责于肾，关乎五脏，五脏之中又数肝与肾气盛衰关系最为密切，临证主张以养为主，刚柔并济，以柔驯刚。周惠芳[24]认为，PMS 尤以肾阴虚为根本，强调心、肝、肾三脏同治的重要性。本研究频次分析结果显示，PMS 用药以补虚药占比最高，其次是清热药；主要归肝经、肾经，其次是心经、脾经；药性以平为主，其次是寒；药味以甘居多，其次是苦。平性药药体和缓，李玲玲等[25]提出“平而有性，有性无用，以味为用”的观点，认为其虽非中正不偏，但更应以味为用。甘味药“能补，能和，能缓”，具有补益调和之用；苦味药“能泄，能燥，能坚”，性质偏于寒凉，清热泻火，以坚肾阴。高频药物山茱萸、熟地黄、白芍、当归、茯苓、山药等，大多为调补肝肾、益阴养血之品，兼具宁心安神、益气健脾之类。由此观之，PMS 治疗应以肾为本，注重滋阴清热，肝肾同调，交通心肾，兼以顾护脾胃。

核心药物关联规则结果显示，二项关联中山茱萸-熟地黄支持度最高，三项关联中熟地黄-山药-山茱萸支持度最高。熟地黄、山药、山茱萸乃经典名方六味地黄丸之“三补”，熟地黄主入肾经，山茱萸主入肝经，山药主入脾经，三药共启补肾、养肝、健脾之效。聚类分析组合1（牡蛎、龙骨、小麦、酸枣仁）养心安神、镇惊除烦，PMS 伴失眠、焦虑者较为适用；组合2（丹参、川芎、白芍、柴胡、当归）疏肝养血、活血行气，适宜肝郁气滞兼血瘀者；组合3为单味药甘草，与诸药配伍以发挥健脾宁心、益气和中、调和药性之功；组合4 的麦冬、五味子酸甘化阴，与黄芪配伍，益气养阴生津，适用于PMS 潮热、盗汗、乏力等症状明显者；组合5（淫羊藿、仙茅、知母、菟丝子）和组合7（女贞子、墨旱莲、地黄）为二仙汤合二至丸化裁，适用于PMS 肾阴阳两虚证[26]；组合6（山茱萸、山药、熟地黄、牡丹皮、泽泻、茯苓）即六味地黄丸原方，其组方精当，滋肾益肝、清泄虚热，乃补阴方药之祖，紧扣PMS 病机之根本，且所含药物均属本研究的核心药物，药物之间关联度较高。研究[27]表明，六味地黄丸可调节雌激素水平，缓解潮热、心悸等血管舒缩症状，明显改善PMS 患者的情绪及睡眠状况。故确定组合6 为本研究核心处方，进一步运用网络药理学方法联合分子对接技术分析其治疗PMS 的分子机制。

网络药理学研究发现，核心处方中的姜黄素、槲皮素、姜黄油树脂、辣椒素e、3-二苯并呋喃磺酸、丁香酚等关键活性成分可能在PMS 治疗中发挥主要作用。姜黄素可以上调色氨酸羟化酶2 及5-羟色胺受体信使RNA，下调单胺氧化酶RNA，从而改善大脑区域的血清素含量，具有类似氟西汀及雌二醇样作用[28]。姜黄油树脂中姜黄素含量达79%～85%，二者功效基本一致。辣椒素可调节免疫，增强抗氧化能力[29]。丁香酚具有抗氧化、抗炎及抗抑郁作用，其通过调控氧化应激，调节雌激素及睾酮激素水平，可对卵巢组织产生保护作用[30]。槲皮素的化学结构与雌二醇相似，具有雌激素样神经保护作用。槲皮素还可以提高脑内5-HT 及乙酰胆碱酯酶水平，抑制单胺氧化酶活性，调节神经递质系统，改善情绪及精神状况[31-33]。本研究通过分子对接亦表明，槲皮素可对7 个核心处方治疗PMS 的关键靶点及卵巢类固醇生成通路所富集的11 个潜在靶点均发挥良好作用，推测槲皮素可能为核心处方治疗PMS 的核心成分。

核心处方治疗PMS 涉及238 个潜在作用靶点，经拓扑分析筛选及分子对接验证，CYP17A1、CYP11A1、STAT3、EGFR、 INSR 可能为核心处方对PMS 发挥治疗作用的核心靶点。既往研究[34]表明，STAT3 可参与调节CAP11A1、CYP19A1 等卵巢类固醇激素合成酶的表达。INSR 基因外显子的突变可导致胰岛素抵抗，进而引起糖代谢紊乱，研究[35]发现，糖代谢障碍可影响下丘脑-垂体-性腺轴正常功能，使雌激素水平波动增加，加重PMS 症状。EGFR为PI3K-Akt 通路中的上游基因，可调节卵巢激素分泌，影响卵泡发育，在雌性生殖系统中起关键作用[36]。

KEGG 通路富集分析显示，潜在作用靶点主要富集于卵巢类固醇生成、PI3K-Akt、脂质和动脉粥样硬化、库欣综合征、河马信号通路等。卵巢类固醇生成通路对维持卵巢生理功能发挥关键作用，CYP11A1、CYP17A1、CYP19A1、LDLR 等11 个潜在作用靶点均在此通路富集。胆固醇为合成雌二醇、睾酮等卵巢类固醇激素的主要原料，尤以低密度脂蛋白（LDL）为主，LDLR 可调节LDL 水平，从而维持卵巢类固醇激素的动态平衡；CYP11A1、CYP17A1、CYP19A1 均为卵巢类固醇激素合成途径中的催化酶，CYP11A1 可催化胆固醇的侧链羟基化，并裂解为类固醇激素前体物质孕烯醇酮，CYP17A1 催化孕烯醇酮转化为孕酮及雄激素的双过程，CYP19A1 参与雌激素合成的最后步骤[37-39]。结果提示，核心处方可能通过调控以上靶点干预卵巢类固醇生成途径，以进一步调节PMS 患者卵巢类固醇水平，改善相关症状。另有研究[40-41]发现，卵巢卵母细胞与颗粒细胞中存在完整的PI3K-Akt 信号通路，PI3K-Akt 信号通路中AKT1 等相关基因表达上调，可提高颗粒细胞存活率，促进卵泡发育，调节雌激素水平。河马信号通路中的主要分子与卵巢生殖干细胞相关因子之间存在密切关系，该通路可通过调节卵巢生殖干细胞增殖进一步调节卵巢功能[42-43]。

综上所述，本研究归纳了中药复方治疗PMS 的用药规律，揭示了PMS 治疗应遵循以肾为本，滋阴清热，肝肾同调，兼顾心脾的治疗原则；基于关联规则分析的常用药对与系统聚类的药物组合可为PMS 辨证施治及新药开发提供一定参考。结合生物信息学分析了核心处方（六味地黄丸）治疗PMS 的可能机制，可为基础实验研究提供一定思路，同时为其临床应用提供理论支持。但本研究仍存在一定局限性，虽探讨了六味地黄丸治疗PMS 的可能机制，并利用分子对接技术进行初步验证，但具体成分与靶点、通路的作用机制仍需进一步的体内外实验加以验证。此外，其他高频药对、药组的作用机制亦值得深入研究。因此，后期将在本研究基础上筛选六味地黄丸及其他高频药对、药组治疗PMS 的关键通路，进行动物或细胞实验，以深入探索中药复方治疗PMS 的机制。