血清HDAC6和PHB1在慢性阻塞性肺疾病患者中的表达及临床意义

彭翔飞 罗明兴

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种由气流受限导致呼吸困难的肺部疾病。COPD是一种可以预防和治疗的慢性气道疾病,通常与显著暴露于香烟烟雾等有害毒颗粒或气体有关,有较高致残率和死亡率[1]。组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)是一类蛋白酶,HDAC6主要存在于细胞质中,是唯一具有两个串联催化结构域的HDAC亚型[2-3]。有研究表明,HDAC6是多种类型肿瘤[4]、神经退行性疾病[5]、炎症性疾病[6]等疾病的治疗靶点。抗增殖蛋白1 (prohibitin 1,PHB1)是一种广泛表达且高度保守的蛋白。PHB1可以参与细胞周期的整个过程,包括细胞周期的存活、凋亡[7]、分化[8]和衰老[9]。PHB1在癌症[10]、炎症[11]、自身免疫疾病[12]等中发挥作用。因此本研究检测了COPD患者血清HDAC6和PHB1的水平,探讨二者的表达与病情严重程度的关系及临床意义,为COPD患者的诊断提供理论临床依据。

资料与方法

一、一般资料

收集2014年6月至2020年7月在本院住院的COPD患者156例,并根据《慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2013 年修订版)》[13]的标准,将COPD患者分为稳定期(稳定期COPD组)和急性加重期(AECOPD组)。其中稳定期COPD组60例,男性38例,女性22例,平均年龄(64.23±4.12)岁;AECOPD组96例,男性56例,女性40例,平均年龄(63.28±4.89)岁。另选择同期在本院体检的健康者148例作为对照组。所有受试者或其家属签署知情同意书,本研究获得本院伦理委员会审核、批准后实施(20140016)。

纳入标准:(1)患者经临床病理确诊,均符合COPD疾病症状[13];(2)心、肝、肾等重要脏器功能基本正常;(3)临床资料齐全;(4) 所有受试者均签署知情同意书。排除标准:(1)肺部以外的全身感染性疾病者;(2)合并自身免疫、肿瘤疾病者;(3)患有其他感染疾病或精神疾病者;(4)患有心、肝、肾和造血系统等严重疾病者;(5)慢性肠道疾病、糖尿病合并严重并发症患者。

二、研究方法

样品采集:采集患者入院次日早晨空腹肘静脉血5mL,稳定期COPD组患者及对照组在随诊及体检当日,均于晨起空腹抽取肘静脉血5mL。所有血液标本于4℃低温冷冻离心机,3000 r/min离心20 min,收集上清液,放置-80℃冰箱中保存待测。

三、观察指标

血清HDAC6水平检测:严格按照人HDAC6 ELISA检测试剂盒(北京杰辉博高生物技术有限公司)说明书配制一系列浓度的标准品溶液,采用酶标仪测定不同浓度标准品在450 nm处的吸光度值,绘制HDAC6的标准品回归曲线。于-80℃冰箱中取适量血清样本,解冻,测定样本在450 nm处的吸光度值,依据标准回归曲线计算血清HDAC6的水平。

血清PHB1的相对表达量检测:按照Trizol试剂(翌圣生物科技(上海)股份有限公司)操作步骤分离提取组织总RNA,RNA的浓度和纯度用紫外分光光度计测定(上海昂拉仪器有限公司),RNA总溶液A240/A280在1.8～2.1范围内,总RNA的纯度较高,表明没有污染,可以用于后续试验。用1%变性琼脂糖凝胶电泳分析提取总RNA的完整性。按逆转录试剂盒(新贝(上海)生物科技有限公司)操作步骤逆转录合成cDNA,以cDNA为模板进行q-PCR。反应体系共20 μL:cDNA(50 ng/μL)2 μL,SYBR Green Master Mix(2×)(北京伊塔生物科技有限公司)10 μL,PCR上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,加ddH2O至20 μL。目的基因PHB1与管家基因GAPHD均使用2-△△Ct函数值(Ct为循环阈值)进行计算(见表1)。

表1 qRT-PCR引物序列

肺功能检查:采用肺功能诊断仪检测(南京贝登医疗股份有限公司),采用肺功能仪检测用力肺活量(forced vital capacity,FVC)、第1秒用力呼气量占用力肺活量比值 (FEV1/ FVC)、呼气峰值流量( peak expiratory flow,PEF)。

四、统计学分析

结 果

一、一般资料比较

如(表2)所示,稳定期COPD组、AECOPD组在性别、年龄、体重指数、吸烟指数方面与对照组均无显著差异,说明三组资料具有可比性(P>0.05)。

表2 三组一般情况比较

二、3组受试者肺功能指标比较

如(表3)所示,稳定期COPD组、AECOPD组的FVC、FEV1/ FVC、PEF均显著低于对照组,且AECOPD组的FVC、FEV1/ FVC、PEF低于稳定期COPD组,差异具有统计意义(P<0.05)。

表3 三组受试者肺功能指标比较

三、三组受试者HDAC6和PHB1水平比较

稳定期COPD组、AECOPD组的HDAC6水平均显著高于对照组(P<0.05),其中稳定期COPD组HDAC6的表达水平较AECOPD组低,差异显著(P<0.05)。稳定期COPD组、AECOPD组的PHB1水平均显著低于对照组,且AECOPD组PHB1的表达水平最低,差异具有统计意义(P<0.05)(见表4)。

表4 三组受试者HDAC6和PHB1水平比较

四、HDAC6和PHB1相对表达水平与肺功能指标的相关性

HDAC6表达水平与FVC、FEV1/ FVC、PEF均呈负相关关系(P均<0.05),PHB1的表达水平与FVC、FEV1/ FVC、PEF呈正相关关系(P均<0.05)(见表5)。

表5 HDAC6和PHB1水平与肺功能指标相关性分析

五、影响AECOPD发生的多因素Logistic回归分析

以 COPD 患者是否为AECOPD为因变量(是=1,否=0),以(表2、4)中有差异的指标HDAC6(实际值)、PHB1(实际值)为自变量进行 Logistic 回归分析,结果发现,血清HDAC6和PHB1为影响AECOPD发生的独立危险因素(OR=3.307、3.635)(见表6)。

表6 影响AECOPD发生的多因素Logistic回归分析

六、血清HDAC6和PHB1诊断AECOPD价值

ROC分析结果显示,HDAC6、PHB1诊断AECOPD的截断值分别为197.35 pg/mL、0.45,曲线下面积(AUC)分别为0.911、0.847,二者诊断AECOPD的灵敏度分别为85.40%、80.20%,特异度为88.30%、76.70%。二者联合诊断的AUC为0.928,灵敏度和特异度为89.60%和91.70%,高于HDAC6、PHB1单独诊断的AUC。其中二者联合诊断优于血清PHB1单独诊断(Z二者联合-PHB1=2.014,P=0.044),与HDAC6单独诊断无差异(Z二者联合-HDAC6=0.523,P=0.601)(见表7、图1)。

表7 血清HDAC6、PHB1诊断AECOPD价值

图1 血清HDAC6、PHB1诊断AECOPD的ROC曲线

讨 论

COPD是一种异质性的慢性呼吸道疾病,常见症状为慢性咳嗽、咳痰、气短或呼吸困难、喘息和胸闷等,可进一步发展为肺心病和呼吸衰竭。COPD的致残率和病死率很高,常发生于中老年人中,COPD患者后期还会并发多种心血管疾病,更进一步加速了患者的致残率和死亡率,并可诱发慢性高碳酸血症呼吸衰竭(CHRF)和肺癌等疾病[14-15],这些都给患者造成了巨大的健康负担,严重损害了患者的生活质量、运动能力和肺功能[16]。因此,寻找能够反映COPD严重程度的特异性生物标志物极为重要。

HDAC6是HDAC中的重要成员,是研究最为广泛的IIb类HDAC。HDAC6基因位于Xp11.23中,负责编码一种含有1215个氨基酸的蛋白质。HDAC6中有两个同源功能催化结构域,它们具有独立的功能[17]。位于HDAC6蛋白C端的泛素结合锌指结构域(ZnF-UBP结构域)在调节泛素化介导的降解中起着至关重要的作用[18]。HDAC6在多种生理和病理过程中发挥重要作用,HDAC6的异常表达会引起癌症、神经退行性变等疾病。如HDAC6在结直肠癌组织中表达上调,且与临床病理特征密切相关,是结直肠癌患者预后的不良独立危险因素[19]。PHB1是一种抗增殖蛋白家族蛋白,与PHB2在线粒体内膜形成一个大的复合体。PHB1最初是从再生的大鼠肝脏中分离出来的,是一种抗增殖基因。PHB1位于染色体17q21区,编码一个30 kDa的蛋白质。有研究表明,PHB1可以通过影响代谢过程在年龄相关疾病中发挥重要作用[20],PHB1具有肿瘤抑制基因的功能,位于细胞核、细胞质和线粒体内膜的PHB1在肝炎和肝硬化中具有抗氧化应激和抗炎作用,可保护肝细胞免受炎症因子和活性氧(reactive oxygen species, ROS)刺激造成的损伤。位于肝癌细胞核的PHB1低表达可抑制肝癌的增殖和转移[21]。

本研究检测了156例COPD 患者(其中稳定期COPD组60例,AECOPD组96例)及148例健康对照者血清中HDAC6、PHB1的水平,结果表明:COPD患者血清中HDAC6水平显著高于对照组,且AECOPD组血清中HDAC6的表达水平显著高于稳定期COPD组;稳定期COPD组和AECOPD组血清PHB1的水平显著低于对照组,且AECOPD组的水平明显低于稳定期COPD组,差异显著。由此可见,血清HDAC6、PHB1表达水平的高低和COPD的病情严重程度有关。本研究检测了对照组、稳定期COPD组、AECOPD组肺功能指标显示,稳定期COPD组和AECOPD组的FVC、FEV1/FVC以及PEF的预测值显著低于对照组,AECOPD组低于稳定期COPD组。说明COPD患者伴有换气及肺通气功能障碍,其中AECOPD组患者肺功能损伤更为明显。通过分析HDAC6、PHB1水平与肺功能指标的相关性表明,HDAC6水平与FVC、FEV1/FVC、PEF呈负相关,PHB1水平与FVC、FEV1/FVC、PEF呈正相关,提示HDAC6、PHB1可能参与了 COPD 患者的疾病进展。 Logistic回归分析显示,HDAC6、PHB1均为影响AECOPD发生的独立危险因素(OR=3.307、3.635,P均<0.05);同时ROC分析结果表明HDAC6、PHB1检测对AECOPD均具有较好的诊断价值,而二者联合诊断价值更高,提示二者可以作为诊断COPD患者疾病程度的指标,对COPD的筛查和明确诊断提供客观依据。

综上所述,血清HDAC6在COPD患者中高表达,血清PHB1在COPD患者中低表达,HDAC6、PHB1表达水平的高低与 COPD 患者疾病严重程度及肺功能有关,可用于病情评估,具有一定的临床意义。然而HDAC6、PHB1参与COPD发生发展的具体机制仍需进一步加大样本来探究。