微小RNA-223调控白细胞介素-6/信号转导与转录激活因子3信号通路改善慢性肾小球肾炎大鼠炎症反应和纤维化的机制研究

韦泽丰 郑金花 王自强

慢性肾小球肾炎(CGN)是一类免疫介导的原发性肾小球疾病,以蛋白尿、水肿、高血压、血尿为基本临床特征,约占慢性肾脏病患者的20%[1]。CGN易复发,如疾病进展且未得到有效治疗,最终会导致肾功能衰竭,严重威胁患者生命健康。CGN的发病机制多种多样,其中免疫介导的炎症损伤是CGN发生发展的中心环节[2]。微小RNAs(miRNAs)是一组小的RNA片段,在免疫炎症介导的疾病调控机制中发挥重要作用。在已知的miRNAs中,miR-223是免疫系统进化和稳态的关键因素,主要调节特定的炎症反应。相关研究报道结果显示,miR-223在慢性肾脏病中表达下调[3],miR-223下调可通过促进肾小球内皮细胞活化加重IgA肾病组织损伤[4]。但miR-223在CGN中的研究报道较少,因此,本研究以CGN大鼠模型为研究对象,旨在探索miR-223在CGN中的作用及相关分子机制。

材料与方法

1.材料:SPF级雄性SD大鼠,体质量180～220 g,购自海南药物研究所有限责任公司[生产许可证号:SCXK(琼)2020-0007]。大鼠在21～23 ℃、相对湿度50%～60%、12 h光暗交替的标准条件下饲养,适应性喂养1周后开始实验。主要试剂:阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)干粉、弗氏不完全佐剂购自美国Sigma公司;miR-223激动剂(miR-223 agomir)及其阴性对照(NC agomir)均购自广州市锐博生物科技公司;重组人IL-6(rhIL-6)购自上海MEC公司;HE染色试剂盒、Masson染色试剂盒均购自武汉佳维斯生物医药公司;尿蛋白定量试剂盒、尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、胱抑素C(Cys-C)、视黄醇结合蛋白(RBP)、IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;反转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒均购自河北三狮生物科技有限公司;甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、IL-6、信号转导与转录激活因子3(STAT3)、磷酸化STAT3(p-STAT3)一抗及山羊抗兔IgG二抗均购自英国Abcam公司。

2.方法

(1)造模:按照参考文献[5]中的方法,通过注射C-BSA建立CGN大鼠模型:将C-BSA干粉用生理盐水溶解配置成2 mg/ml溶液,按1∶1比例加入弗氏不完全佐剂制备成终浓度为1 mg/ml的C-BSA乳剂在大鼠皮下部位多点注射,每只大鼠注射2 mg、每周1次。第2周起,取适量C-BSA干粉溶于生理盐水制成2.5 mg/ml溶液在大鼠尾静脉注射,每只大鼠注射2.5 mg、每周3次,持续3周。尾静脉注射3周后测定大鼠24 h尿蛋白量,24 h尿蛋白/大鼠体质量>50 mg/kg为CGN模型建立成功。

(2)分组与给药:结合既往研究结果和预试验[6-7]确定给药剂量,将造模成功CGN大鼠随机分为模型组(CGN组,尾静脉注射等体积生理盐水)、NC agomir组(尾静脉注射50 μg/kg NC agomir)、miR-223 agomir组(尾静脉注射50 μg/kg miR-223 agomir)、miR-223 agomir+IL-6/STAT3通路激活剂组(miR-223 agomir+rhIL-6组,尾静脉注射50 μg/kg miR-223 agomir和1 μg/kg rhIL-6),每组各10只。正常饲养的10只大鼠设为对照组(Control组,造模期间同时期同部位注射等量生理盐水,给药期间尾静脉注射等体积生理盐水)。各组均每隔3 d注射1次,持续进行21 d。

(3)样本采集:给药结束后,收集大鼠24 h尿液,离心保存上清液。给药结束后24 h,麻醉大鼠,腹主动脉采集5 ml血液,离心收集血清,用于生化指标分析。处死大鼠,取大鼠肾组织,分为两部分,一部分固定在4%多聚甲醛溶液中用于组织检查,另一部分经液氮快速冷冻后,保存至-80 ℃用于后续检测。

(4)大鼠肾功能指标测定:采用尿蛋白定量试剂盒测定大鼠24 h尿蛋白水平。采用ELISA试剂盒测定大鼠血清中BUN、SCr、Cys-C、RBP水平。实验操作均严格按照试剂盒说明书进行。

(5)组织学检查:将4%多聚甲醛溶液固定的肾组织用石蜡包埋,切成5 μm厚的切片,按照试剂盒说明书进行HE染色和Masson染色,显微镜下观察,采用Image Pro Plus 6.0软件进行半定量分析,计算蓝染的胶原纤维面积与整个视野总面积的比值。

(6)大鼠肾组织炎症因子水平检测:取适量大鼠肾脏制成组织匀浆液,离心后取上清液检测肾组织中TNF-α、IL-1β和MCP-1水平,操作过程严格按ELISA试剂盒说明书进行。

(7)qRT-PCR:从肾组织中提取总RNA,逆转录成cDNA。以cDNA为模板,开展qRT-PCR实验检测miR-223表达水平。使用2-△△Ct法量化分析。

(8)Western blot:提取肾组织总蛋白,10% SDS-PAGE分离并转移至PVDF膜上,5%脱脂奶粉室温下封闭2 h,加入1∶1 000稀释的一抗(IL-6、STAT3、p-STAT3、GAPDH)在4 ℃孵育过夜,1∶2 000稀释的二抗室温下孵育2 h,ECL试剂显色,使用Image Pro Plus 6.0软件量化蛋白条带灰度值。

结 果

1.5组大鼠肾功能指标及肾组织炎症因子水平比较:与Control组比较,CGN组大鼠24 h尿蛋白、BUN、SCr、Cys-C、RBP及肾组织TNF-α、IL-1β和MCP-1水平均升高(P<0.05);与CGN组比较,NC agomir组大鼠上述指标水平变化差异均无统计学意义(P>0.05),miR-223 agomir组大鼠上述指标水平均降低(P<0.05);与miR-223 agomir组比较,miR-223 agomir+rhIL-6组大鼠上述指标水平均升高(P<0.05)。见表1。

表1 5组大鼠肾功能指标及肾组织炎症因子水平比较

2.5组大鼠肾脏组织病理结果:镜下观察,Control组大鼠肾小球形态正常,肾小管之间排列紧凑,肾间质内无明显病理改变;CGN组和NC agomir组大鼠肾小球萎缩,肾小管管腔扩张且内有蛋白质管型形成,肾间质变宽,可见明显炎性细胞浸润;miR-223 agomir组较CGN组大鼠肾脏组织病理损伤显著改善;miR-223 agomir+rhIL-6组较miR-223 agomir组大鼠肾脏组织病理损伤明显加重。见图1。

图1 5组大鼠肾脏组织病理结果(A:Control组;B:CGN组;C:NC agomir组;D:miR-223 agomir组;E:miR-223 agomir+rhIL-6组;HE染色,×400)

3.5组大鼠肾脏组织纤维化情况比较:与Control组[(3.84±0.51)%]比较,CGN组[(38.51±3.60)%]大鼠肾间质纤维化面积增加(P<0.05);与CGN组比较,NC agomir组[(36.93±3.75)%]大鼠肾间质纤维化面积变化差异无统计学意义(P>0.05),miR-223 agomir组[(11.43±1.58)%]大鼠肾间质纤维化面积减少(P<0.05);与miR-223 agomir组比较,miR-223 agomir+rhIL-6组[(23.80±2.11)%]大鼠肾间质纤维化面积增加(P<0.05)。见图2。

图2 5组大鼠肾脏组织纤维化情况比较(A:Control组;B:CGN组;C:NC agomir组;D:miR-223 agomir组;E:miR-223 agomir+rhIL-6组;Masson染色,×400)

4.5组大鼠肾组织miR-223表达水平比较:与Control组(1.00±0.10)比较,CGN组(0.31±0.03)大鼠肾组织miR-223 mRNA表达水平降低(P<0.05);与CGN组比较,NC agomir组(0.32±0.03)大鼠肾组织miR-223 mRNA表达水平变化差异无统计学意义(P>0.05),miR-223 agomir组(0.89±0.09)大鼠肾组织miR-223 mRNA表达水平升高(P<0.05);与miR-223 agomir组比较,miR-223 agomir+rhIL-6组(0.86±0.09)大鼠肾组织miR-223 mRNA表达水平变化差异无统计学意义(P>0.05)。

5.5组大鼠肾组织IL-6/STAT3信号通路相关蛋白表达水平比较:与Control组比较,CGN组大鼠肾组织IL-6蛋白表达水平、p-STAT3/STAT3比值均升高(P<0.05);与CGN组比较,NC agomir组大鼠肾组织IL-6蛋白表达水平、p-STAT3/STAT3比值变化差异均无统计学意义(P>0.05),miR-223 agomir组大鼠肾组织IL-6蛋白表达水平、p-STAT3/STAT3比值均降低(P<0.05);与miR-223 agomir组比较,miR-223 agomir+rhIL-6组大鼠肾组织IL-6蛋白表达水平、p-STAT3/STAT3比值均升高(P<0.05)。见表2。

表2 5组大鼠肾组织IL-6/STAT3信号通路相关蛋白表达水平比较

讨 论

miR-223是免疫细胞分化和炎症的有效调节剂,参与调节多种炎症性疾病的发生进展。相关研究显示,miR-223过表达可通过抑制NLRP3炎性体来改善肾缺血再灌注损伤和草酸钙肾钙盐沉着症引起的肾脏损伤[8-9]。本研究miR-223过表达可降低CGN大鼠肾功能指标水平,并显著改善CGN大鼠肾脏病理损伤,表明miR-223过表达在CGN中起到肾脏保护作用。

CGN发病机制之一是中性粒细胞和淋巴细胞等释放的细胞因子诱导发生炎症反应,可引起肾小球损伤、肾纤维化等[10]。既往研究结果发现,减少TNF-α、IL-1β等炎症因子的释放有助于缓解CGN[11]。趋化因子MCP-1作为炎症和纤维化相关细胞因子,被检测到在自身免疫性肾小球肾炎患者尿液中表达增加[12]。据报道,miR-223过表达可抑制TNF-α和IL-1β产生,反之,miR-223缺乏可促进IL-6、IL-1β和MCP-1释放,加重机体炎症反应[13-14]。此外,Róka等[15]发现,miR-223参与调控缺血诱导的小鼠肾纤维化进展及纤维蛋白表达。本研究结果显示,miR-223过表达降低了CGN大鼠肾组织TNF-α、IL-1β和MCP-1水平,减少了大鼠肾间质内胶原纤维沉积,提示miR-223过表达能够有效抑制CGN大鼠肾脏炎症反应和肾纤维化。

IL-6/STAT3信号传导通路在炎症、分化和免疫调节中起着重要作用。miR-223已被证实可通过调控IL-6/STAT3途径调节免疫炎症反应[16]。相关研究结果表明,急性肾损伤诱导的肾间质纤维化和肾小球硬化与IL-6表达增加及STAT3信号通路激活有关[17]。IL-6/STAT3信号通路介导的自噬可能参与年龄相关性肾小球硬化症的进展[18]。本研究对miR-223是否通过调控IL-6/STAT3途径在CGN中发挥作用进行探讨,结果显示,miR-223 agomir干预后,CGN大鼠肾组织中miR-223表达增加,IL-6蛋白表达水平和STAT3磷酸化水平显著降低,提示miR-223过表达可能抑制CGN中的IL-6/STAT3信号通路。为进一步证实该结果,本研究以IL-6/STAT3通路激活剂rhIL-6联合miR-223 agomir干预CGN大鼠,结果显示,rhIL-6显著逆转了miR-223过表达改善的CGN大鼠病理症状、抑制了IL-6/STAT3信号通路的活化作用。

综上所述,miR-223过表达可改善CGN大鼠肾脏炎症反应和肾纤维化,其可能通过抑制IL-6/STAT3信号通路活化发挥肾脏保护作用。本实验结果为研究CGN的发病机制和治疗方案提供了一定参考依据,但miR-223在CGN中的基因调控机制尚未完全阐明,仍有待进一步研究探讨。