葛根黄酮的闪式提取工艺及其保肝作用研究

丁昱婵，秦令祥,*，丁艳芳，高愿军

（1.漯河食品职业学院，河南 漯河 462300；2.漯河市食品研究院有限公司，河南 漯河 462300；3.河南和生食品有限公司，河南 漯河 462300；4.郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南 郑州 450002）

葛根又名葛藤、粉葛藤等，为豆科植物野葛的干燥根[1-2]，素有“亚洲人参”的美誉[3]，在我国有悠久的入药历史[4]。葛根中含有碳水化合物、蛋白质、膳食纤维等多种营养物质，以及三萜类、黄酮类、生物碱类等生物活性物质，此外还含有多种微量元素和氨基酸等[5-6]。黄酮类物质达30余种，主要为葛根素、金雀异黄素、大豆苷、大豆苷元、染料木素和香豆素，其中葛根黄酮是葛根中的一种生物活性物质，具有抗肿瘤、抗氧化、改善血液循环、降血糖、降血脂和提高免疫力等多种功效[7-13]。

目前，葛根黄酮提取方法主要有：乙醇回流法[14]、复合酶法[15]、超声辅助法[16]、微波法[17]等，这些方法各有优缺点。目前，闪式提取法[18]是一种新型提取方法，它是利用闪提器内刀刃间形成的超速动态分子渗透、高剪切和强力搅拌振动作用，迅速破坏植物细胞，使其细胞内的功能成分溶出，达到高效提取功能成分的作用，具有提取时间短、效率高、能耗低等显著特点[19-20]。因此，本文采用闪式提取法提取葛根黄酮，通过正交试验优化提取工艺，并对其解酒保肝作用进行初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

葛根：漯河张仲景大药房；芦丁（分析标准品，97%）：广州分析测试中心科力技术开发公司；SPF级小鼠：实验动物许可证号为SCXK(豫）-2020-0005，证书编号为C57BL/6j，体重（20±2）g，河南斯克贝斯生物科技有限公司；无水乙醇、氢氧化钠、无水磷酸氢二钠、硝酸铝、亚硝酸钠：均为分析纯；联苯双酯、四氯化碳：郑州化学试剂厂；谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒：上海经科化学科技有限公司；AB-8型大孔树脂：天津波鸿树脂科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备

Quintix 224-ICN电子分析天平，郑州莱博仪器设备有限公司；WK-400B小型高速粉碎机，济南博创制药设备有限公司；HH-4D 型单独控温四孔数显水浴锅，DZF-6020AB 真空干燥箱，北京中兴伟业世纪仪器有限公司；EV4000 VAC 型旋转蒸发仪，上海常豫仪器有限公司；JHBE-50T 闪式提取器，河南智晶生物科技有限公司；UV2600 型双光束紫外可见分光光度计，日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 芦丁标准曲线的绘制

参照赵成萍等[21]的方法，并加以改进：准确称取0.100 0 g 芦丁，加入体积分数为95%的乙醇溶解、摇匀，并定容至1 000 mL，制成0.1 mg/mL的芦丁标准溶液。取刻度为10 mL的试管6支，分别用编号1、2、3、4、5、6 标记，然后分别加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL芦丁标准溶液。依次加入5%的亚硝酸钠溶液0.3 mL和10%的硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min，再加入1 mol/L的氢氧化钠溶液4 mL，摇匀，静置15 min，最后用95%的乙醇定容至10 mL。在波长510 nm 处测其吸光度，绘制芦丁标准曲线，得到回归方程。

1.2.2 葛根黄酮的提取及其得率测定

参照龚频等[22]的方法提取及测定葛根黄酮得率。准确称取粉碎后的葛根10 g 于锥形瓶中，以95%的乙醇作溶剂，分别在不同料液比、提取时间、提取次数和提取压力的条件下进行闪式提取。提取完成后，在5 000 r/min 的条件下离心20 min，然后取其上清液并浓缩，再用AB-8型大孔树脂纯化[23]，最后将其真空干燥即可得到葛根黄酮。并按照“1.2.1”的方法测定吸光度，葛根黄酮得率计算公式如下：

式中：V为葛根黄酮提取液的体积，mL；C为标准曲线回归方程得到的葛根黄酮质量浓度，mg/mL；m为葛根样品质量，mg。

1.2.3 单因素试验设计

以葛根黄酮得率为考察指标，按照“1.2.2”中的方法进行提取，在预试验的基础上，设定固定条件：提取电压150 V，提取时间90 s，提取次数2次，料液比1∶25（g/mL），考察不同提取电压（120、130、140、150、160 V）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL））、提取时间（60、70、80、90、100 s）和提取次数（1、2、3、4、5 次）对葛根黄酮得率的影响，然后按“1.2.2”的方法测定并计算其得率。

1.2.4 正交试验设计

在单因素试验的基础上优化提取条件，进行L9(34)正交试验，试验因素水平见表1。

综合来看，随着网络信息技术的不断发展，线上服务和线下服务的融合兼并，基于互联网构建的交易平台对消费者和服务提供者具体应该承担的责任范围和责任内容还有待商榷。把包含人身从属性质、但又包含其自身特殊性的用工关系归入法律范围，并利用法律武器加以保护，这也是对现代法治社会、现代法治文明的有力体现。同时扩大劳动关系界定标准，对其概念加以宏观阐释，可以使传统的劳动合同制更加适应不断发展演变的新时代要求。而对网约车平台和驾驶员两间的法律关系和责任的明确界定，不仅可以加强对驾驶员行为的监管约束，也可以净化服务环境，优化服务质量，进一步规范网约车行业以良好态势发展。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.5 模型建立的方法

将40 只SPF 级雄性小鼠，饲养于温度（26±2）℃，湿度50%～60%，噪音60分贝以下，照明12 h（每日8：00开灯，20：00关灯）的动物房内，喂养7 d后，随机分为4组，分别为：正常对照组、CCl4对照组（CCl4诱导小鼠肝损伤可称为模型组）、联苯双酯组(联苯双酯治疗肝损伤，可称为阳性对照组）、葛根黄酮提取液试验组，每组10只。正常对照组和CCl4对照组每天均灌胃等体积的生理盐水。联苯双酯组每天灌胃200 mg/kg联苯双酯，葛根黄酮提取液试验组每天灌胃300 mg/kg葛根黄酮提取液（剂量参照《中华人民共和国药典》[24]）。每天灌服1 次，共灌服7 d。在末次灌服2 h后，除正常对照组外，其他组均按10 mL/kg 腹腔注射0.1%的CCl4。小鼠禁食16 h后测定各指标。

1.2.6 小鼠生化指标的测定

末次灌服后禁食16 h，取小鼠眼球血，然后离心分离血清，离心条件为：4 ℃，4 000 r/min，20 min，然后测定血清中ALT、AST活性和MDA含量。同时，取小鼠肝组织，置于-70 ℃下，冷冻待用。按肝组织质量∶生理盐水体积＝1∶9（g/mL）的比例混合，制成10%肝组织匀浆。并测定肝组织中SOD 和GSH-Px 活性。血清中ALT、AST 活性和MDA 含量及肝组织中SOD和GSH-Px活性测定均按试剂盒操作说明书操作。

1.2.7 数据处理

每组试验重复3次，结果取平均值。试验数据采用Excel 2013 进行整理，采用正交设计助手ⅡV3.1专业版进行设计和分析。

2 结果与分析

2.1 闪式提取葛根黄酮的单因素试验结果

2.1.1 料液比的确定

由图1 可以看出，在一定范围内，随着乙醇添加比例的增加，得率不断升高，而超出一定范围（料液比1∶25（g/mL））后，得率不再提高而趋于稳定。这是因为，在一定范围内，随着溶剂的增加，葛根与溶剂的传质推动力和接触面积增大，促使葛根黄酮的扩散增多，得率提高；但溶剂到达一定量后，传质推动力不再增加，抑制了葛根黄酮的扩散和溶出，得率不再提高而趋于稳定，故选择适宜料液比为1∶25（g/mL）。

图1 料液比对葛根黄酮得率的影响Fig.1 Effects of solid-liquid ratios on extraction rates of total flavonoids from Pueraria lobata Tubers

2.1.2 提取电压的确定

由图2 可知，随着提取电压升高，得率先升高后趋于平缓。这是由于升高提取电压，增大了闪式提取的转速，使葛根细胞破壁增多，葛根黄酮易于溶出，得率升高。当提取电压≥150 V后，葛根黄酮的溶出基本完全，再增加电压，得率也不会明显提高而趋于稳定，故选择适宜提取电压为150 V。

图2 提取电压对葛根黄酮得率的影响Fig.2 Effects of extraction voltages on extraction rates of total flavonoids from Pueraria lobata Tubers

2.1.3 提取时间的确定

由图3 可知，随着提取时间的延长，得率不断升高，最后逐渐趋于平缓。这是因为物料随着提取时间的延长受到剪切、碰撞的作用增强，使葛根细胞破碎的程度增强，葛根黄酮的溶出增多，得率增大。当提取时间超过90 s后，葛根细胞内外溶剂浓度达到平衡，再继续增加提取时间，葛根黄酮溶出不再显著变化，而趋于平缓，因此选择适宜提取时间为90 s。

图3 提取时间对葛根黄酮得率的影响Fig.3 Effects of extraction time on extraction rates of total flavonoids from Pueraria lobata Tubers

2.1.4 提取次数的确定

由图4 可知，首次提取后，提取出的葛根黄酮并不彻底，得率仅为3.38%，经第2 次提取，葛根黄酮得率快速增加，达到6.51%，当超过3 次后，葛根黄酮溶出基本完全，继续增加提取次数，黄酮得率也不再提高，故选择适宜提取次数为2次。

图4 提取次数对葛根黄酮得率的影响Fig.4 Effects of extraction times on extraction rates of total flavonoids from Pueraria lobata Tubers

2.2 正交试验结果

在单因素试验结果的基础上，进行L9(34)正交试验，结果如表2所示，方差分析见表3。

表2 正交试验结果Table 2 The result of orthogonal experiment

表3 方差分析结果Table 3 The variance analysis results

由表2和表3分析可知，各因素的影响大小顺序为：D＞A＞B＞C，提取次数和料液比对葛根黄酮得率的影响达到显著水平（P＜0.05），其他因素的影响不显著。经R值分析，最佳工艺条件为：A3B3C1D2，即提取次数2 次，料液比1∶30（g/mL），提取电压160 V，提取时间80 s。对上述最佳工艺条件进行3 次验证试验，得到葛根黄酮平均得率为6.71%，高于正交试验中各组合，明显高于朱德艳[14]采用乙醇回流法提取的葛根黄酮得率（1.62%），且闪式提取法时间短、温度低，可有效降低提取成本。

2.3 葛根黄酮提取液对四氯化碳致肝损伤小鼠模型的保肝作用影响研究

2.3.1 小鼠血清中AST、ALT活性测定结果

由表4 可知，葛根黄酮提取液试验组的AST 和ALT 活性与CCl4模型组相比差异极显著（P＜0.01），表明葛根黄酮提取液明显降低了CCl4所致的小鼠血清中ALT和AST的活性，具有保肝作用。与正常对照组相比，CCl4模型组AST和ALT活性极显著升高（P＜0.01），说明CCl4能导致小鼠肝损伤。与CCl4模型组相比，联苯双酯组AST 和ALT 活性显著降低（P＜0.05），但没有葛根黄酮提取液组下降得多，说明联苯双酯能有效治疗肝损伤，但效果不如葛根黄酮提取液好。

表4 小鼠血清中AST、ALT活性测定结果Table 4 Determination results of AST and ALT activities in mice sera（n=10） 单位：U/L

2.3.2 小鼠血清中MDA 含量和肝组织中GSH-Px、SOD活性测定结果

由表5可知，CCl4模型组与正常对照组相比，小鼠血清中MDA 含量极显著升高（P＜0.01），肝组织中GSH-Px 和SOD 活性极显著降低（P＜0.01）。与CCl4模型组比较，联苯双酯组小鼠肝组织中GSH-Px 和SOD活性显著升高（P＜0.05）；葛根黄酮提取液试验组小鼠血清中MDA含量显著降低（P＜0.05），GSH-Px和SOD活性极显著升高（P＜0.01）。表明葛根黄酮提取液能够显著降低CCl4所致的小鼠血清中的MDA含量，同时提高小鼠肝组织中GSH-Px和SOD活性。

表5 小鼠血清中MDA含量和肝组织中SOD、GSH-Px活性测定结果Table 5 Determination results of MDA contents in sera and SOD,GSH-Px activities in liver tissues of mice（n=10）

3 结论

本文采用闪式法提取葛根黄酮，在单因素试验的基础上，经正交试验对其工艺进行优化，得到最佳工艺条件为：提取次数2次，料液比1∶30（g/mL），提取电压160 V，提取时间80 s，在此条件下，葛根黄酮得率达6.71%。该方法省时、节能、高效、环保。通过动物实验可知，葛根黄酮能够降低小鼠血清中ALT、AST活性和MDA含量，提高小鼠肝组织中GSH-Px和SOD活性，表明其具有明显的保肝作用。本试验可为葛根黄酮的提取及应用研究提供参考。