库普弗细胞与肝缺血/再灌注损伤的研究进展

贾德功，李慧源，贾志兴，程颖（.新乡医学院第一附属医院普通外科，河南卫辉 4500；.新乡医学院第一附属医院儿科重症科，河南 卫辉 4500；.中国医科大学附属第一医院器官移植科，辽宁 沈阳 000）

肝移植是目前治疗终末期肝病、限值标准内的肝癌、以及急性肝衰竭的最有效方法。随着外科技术的持续改进、器官保护和免疫抑制规范管理以及重症监护的完善，使得肝移植术后患者1 年生存率可达到90%以上［1］。但仍有一些问题是无法彻底解决的，如缺血/再灌注损伤（ischemia and reperfusion injury，IRI）。肝IRI 是血流及氧气被剥夺后重新恢复的一种自相矛盾的组织反应［2］。主要包括两个阶段的病理生理过程：分别是以三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、糖原耗竭和线粒体功能障碍引起的细胞损伤为特征的缺血期，及血流及氧供恢复后以组织损伤加重为特征的再灌注期［3-4］。肝IRI 是导致移植物功能障碍和移植后肝功能衰竭的主要原因，是肝移植临床实践中急需解决的主要问题［2，5］。减轻IRI 不仅可以改善肝移植临床预后，还可以利用边缘供肝移植，从而扩大供体库。然而，目前缺乏有效减轻IRI 的方法。

IRI 早期特征为再灌注后库普弗细胞（kupffer cell，KC）的快速活化，活化的KC 细胞释放活性氧（reactive oxygen species，ROS），包括超氧阴离子和过氧化氢，引起氧化应激以及肝实质和血管损伤。KC 是固有免疫应答的重要组成部分，是体内最大的巨噬细胞群，在正常成年小鼠中，KC 约占肝细胞的35%，占全身巨噬细胞的80%～90%。KC 与肝前体细胞的分化、肝细胞脂质和碳水化合物代谢的调节、肝纤维化以及肝癌等肝脏的一系列病理状态密切相关［6］。KC 激活并发生极化被证明与肝IRI的发生发展密切相关［7］。因此，通过干预KC 的激活与极化来减轻肝IRI 已成为肝移植领域重要的研究方向。

本文就KC 的活动及作用，KC 与肝IRI 的关联，以及如何通过调控KC 干预肝IRI 进行了综述。

1 KC 的活动及作用

KC 是位于肝窦血管内皮管腔侧的肝巨噬细胞［8-9］。KC 具有清除病原体、吞噬细胞碎片和调节铁代谢等功能，这些对维持肝脏稳态至关重要［10］。在肝脏中，KC 是自我更新、静止和不迁移的。当然，当肝损伤期间KC 数量减少时，其也能依靠单核细胞来源的巨噬细胞、以及招募腹膜巨噬细胞和脾脏巨噬细胞等得到补充［8，11］。

在各种因素的刺激下，巨噬细胞可分化成不同的表型，表现出不同的特性和作用，从而在机体的生理和病理活动中发挥不同的调节功能，这被称为巨噬细胞的极化效应［12］。一般情况下，巨噬细胞根据分泌的细胞因子和细胞表面标志物的不同分为M1 型和M2 型，当然也存在其他亚型，但是M1 型和M2 型是目前研究应用最多的亚型。当器官出现严重感染或炎症反应时，巨噬细胞首先极化为M1型，M1 型巨噬细胞也被称为炎性巨噬细胞，因为它们可以分泌大量的促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、白细胞介素-12（interleukin-12，IL-12）和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synase，iNOS）等，促进炎症反应，并具有消除细菌、病毒和真菌等引起的感染的功能［13］。如果M1 型持续大量存在，将会导致组织损伤。此时大量KC 激活并极化成M2 型，M2 巨噬细胞被称为抗炎巨噬细胞，因为M2 巨噬细胞主要产生抗炎因子，如IL-10（interleukin-10，IL-10）、转化生长因子-β（transforming growth factor-beta，TGF-β）、精氨酸酶1（arginase-1，Arg-1），抑制炎症反应，促进组织修复、重塑、血管生成，防止M1 型KC 极化所致过度损伤，维持体内平衡［12］。巨噬细胞的极化主要与高迁移率族蛋白B/Toll 样受体4、酪氨酸激酶/ 信号传导与转录活化因子、TGF-β/Smads、氧化物酶体增殖物激活受体-γ（peroxisomeproliferatorsactivatedrec eptors，PPAR-γ）、Notch、微小RNA （microRNA，miRNA）等信号通路有关。除此之外，丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）、哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）等其他信号通路也可能参与其中［14］。因此，靶向这些信号通路可以调节巨噬细胞的极化，从而改变巨噬细胞在肝脏疾病中的作用。

综上所述，在生理状态下，KC 主要发挥吞噬和清除作用，维持机体稳态。在病理条件下，它们可以改变表型，在免疫及炎症反应中发挥重要作用。

2 IRI 与KC

肝脏IRI 是一个动态的两阶段过程，涉及肝脏局部缺血应激和炎症介导的再灌注损伤［15］。其主要表现为内皮细胞损伤和线粒体肿胀、血管收缩、白细胞浸润和血小板聚集，最终导致微循环阻塞［16］。

在肝IRI 的最初阶段，细胞因缺氧和代谢紊乱而损伤，受损的肝细胞通过细胞内黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶产生ROS［14］。这些ROS 导致细胞内钙离子浓度失衡，改变细胞PH 值，导致细胞死亡和肝损伤，并释放危险相关分子模式（dangerassociated molecular pattern，DAMP）。DAMP 通过不同的TLR 通路激活KC 极化至M1 表型，释放TNF-α 等炎症因子，进一步释放ROS，促进肝损伤［17］。虽然现阶段肝脏缺血/再灌注损伤程度较轻，但会引起一系列晚期损伤，包括产生一系列促炎因子，招募活化的白细胞，引起明显的肝脏损伤［14，17］。可以观察到，肝脏IRI 发生8 ～72 h 后，组织中M1 型巨噬细胞数量增加，而肝脏IRI 发生48 ～72 h 后，肝脏中M2 型巨噬细胞增多，逐渐取代早期占主导地位的M1 型巨噬细胞［18］。M2 型巨噬细胞主要由IL-4/13 刺激巨噬细胞极化而来，极化后的M2 巨噬细胞可分泌IL-10、肿瘤坏死因子-β（tumor necrosis factor，TNF-β）等抗炎因子，减轻肝IRI。其中，IL-10 可抑制抑制核因子-κB（nuclear factor-kappa，NF-κB）的激活，并强烈抑制TNF-α、IL-1β、γ-干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、IL-2 和巨噬细胞炎症蛋白-2 （macrophage inflammatory ptotein -2，MIP-2）分泌［19］。IL-10不仅可以进一步极化巨噬细胞为M2 型，还可以抑制TNF-α 和E 选择素、细胞间黏附因子-1 等细胞表面黏附分子的表达。同时，这些黏附分子也需要TNF-α 的活化，这进一步抑制了黏附分子的作用，减轻了肝脏IRI［20］。

由此可见，KC 在肝IRI 的发生发展中发挥着重要作用，KC 可作为干预肝IRI 的靶点。

3 通过调节KC 干预IRI

目前，调节KC 功能已成为减轻IRI 的研究热点，已发现了多种通过调节KC 激活及极化从而减轻肝IRI 的方法。

3.1 IRI 所导致的酸性微环境通过增加iNOS 和单核细胞趋化蛋白（monocyte chemoattractant protein，MCP）-1 的表达，从而增强KC 向M1 的极化，促进TNF-α、IL-6 等细胞因子释放。研究表明通过注射NaHCO3进行碱化可以减轻KC 向M1 的极化，降低TNF-α、IL-6 等细胞因子水平，减轻肝IRI［21］。Jinjin Peng 等通过高通量实验筛选出了一种催化E1A 相关蛋白p300 / CREB 结合蛋白的高选择性抑制剂A-485，发现其可减少病理性促炎基因的表达，导致急性肝损伤小鼠模型炎症通路激活减少，M1型极化减少，和白细胞浸润减少［22］。这种小分子抑制剂具有广阔的治疗前景，值得进一步探讨。

3.2 促进巨噬细胞向抑炎型M2 型极化：在缺氧条件下，TGF-β 表达上调，其可能通过受体酪氨酸激酶/磷脂酰肌醇-3-激酶通路增加M2 极化从而减轻IRI［23］。PPAR-γ 是核受体家族转录因子的一员，是一个庞大而多样的蛋白群，介导配体依赖的转录激活和抑制。该受体在巨噬细胞中高度表达，其激活与抗炎巨噬细胞表型的上调和促炎巨噬细胞表型的下调有关，从而导致炎症反应的降低。在小鼠模型中，PPAR-γ 激动剂显著改善了小鼠肝缺血/再灌注损伤。与对照组相比，血清谷草转氨酶显著降低，肝脏中M1 巨噬细胞比例降低，M2 巨噬细胞比例增加［24］。

3.3 MicroRNA：有研究表明，在MicroRNA-155（miR-155）敲除的小鼠IRI 动物模型中，敲除miR-155 会降低 IRI 后 KC 中 CD80、CD86 和主要组织相容性复合体 II 的表达，使得促炎细胞因子的分泌受到抑制，抗炎因子IL-10 增强，促进KC 极化成M2 型，从而改善肝IRI，而这种保护作用可以被KC 灭活剂氯化钆所逆转［25］。而Huang 等［26］发现miR-450b-5p 抑制了α 晶状体球蛋白B 活性，使经典的NF-κB 信号通路增强，促炎因子表达增加，从而促进M1 极化，加重肝IRI。这些研究表明miRNA 通过调控KC 极化来干预肝IRI，具有可行性。miR-21、miR-34a、miR-99b 等多种miRNA 都被证明能调控KC 的极化［27-29］，但其在肝IRI 中的作用及机制未见相关文献报道，这值得我们进一步探索及研究。

3.4 长链非编码RNA：含有200 个碱基对的非蛋白编码转录本被称为长链非编码RNA （long non-coding RNA，lncRNA），在多种分子机制中发挥作用，包括细胞分化、凋亡和转移［30］。基于一系列M2 巨噬细胞的极化模型，通过lncRNA 微阵列分析，共记录了25 个表达改变的lncRNA。其中，lncRNA-MM2P是唯一可以在M2 巨噬细胞极化过程中上调，而在M1 巨噬细胞中下调的lncRNA。lncRNA-MM2P 的下调阻断了细胞因子驱动的M2 巨噬细胞的极化，而且通过减少信号转导与转录激活因子-6 的磷酸化减弱了M2 巨噬细胞的血管生成促进功能［31］。尚未有研究表明其余lncRNA 在巨噬细胞向M2 型分化中的作用。

3.5 其他：血红素氧合酶（heme oxygenase，HO）-1是IRI 应激所诱导的热休克蛋白32，是肝脏发挥保护机制的重要组成部分。研究表明：HO-1 和一氧化碳（carbonic oxide，CO）与KC 极化密切相关。当炎症发生时，HO-1 的表达增加，随后产生的CO将诱导KC 极化为M2 型，通过产生抗炎细胞因子IL-10 发挥抗炎作用，减轻肝IRI［32］。而HO-1 抑制剂原卟啉（protoporphyrin，SnPP）的加入可促进M1 型KC 的极化，但其在肝IRI 中是否发挥作用尚不清楚［33］。需肌醇酶1α（Inositol-requiring kinase 1α，IRE1α）是内质网上驻留的跨膜信号传感器，在未折叠蛋白反应中发挥了重要作用。研究发现，KC 细胞中IRE1α 的缺失不仅减弱了NLRP3 炎症小体的激活和IL-1 的产生，而且还抑制了iNos 和促炎细胞因子的表达［34］。药理抑制IRE1α’s RNase酶活性可以减弱KC 的炎症小体激活和iNOS 表达，从而减轻小鼠肝IRI。这表明，IRE1α’s RNase 酶活性可能是治疗缺血/再灌注相关的肝脏炎症和功能障碍的一个有希望的靶点。

牛磺酸去氧胆酸、丹参酮IIA 等中成药也可选择性作用于肝巨噬细胞，将肝巨噬细胞极化为M2型，改善肝IRI［35-36］。这表明，中成药在调控KC、减轻肝IRI 方面具有极高的潜力。在肝移植的设置中，IRI 发生的时间点是提前知道的，多种干预可在缺血损伤前通过供体在器官取出前处理实现。此外，离体肝脏灌注是一种新的器官保存技术，在体外肝脏灌注过程中使用药物可诱导移植物在移植时抵抗再灌注损伤。研究表明在大鼠肝移植冷保存时，通过门静脉灌注谷氨酰胺溶解产生的α-酮戊二酸或血管内皮生长因子-c，可调节炎症反应和改变KCs 从M1 到M2 的极化来保护移植肝免受IRI。其机制与上调磷酸化糖原合成酶激酶-3β 和细胞因子信号转导抑制因子1 的表达，抑制NF-κB 活性有关［37-38］。

4 讨论与展望

肝IRI 是影响肝移植术后移植物存活及患者生存质量的重要因素，且严重限制了边缘供肝的使用［39-40］。目前仍没有预防或减轻肝IRI 的具体有效治疗方法。因此，更好地了解肝IRI 的机制是十分重要，这也是许多临床医生关注的问题。肝脏IRI 是由缺血损伤引起的，缺血损伤通过氧化应激和ROS 的产生导致肝细胞的细胞损伤和细胞死亡，触发局部无菌免疫反应，其特征是KC 和中性粒细胞的招募。在正常肝脏中，KC 被称为肝脏的前哨细胞，位于肝窦内，占肝巨噬细胞的大多数，并占主导地位，主要维持肝脏稳态。KC 有能力改变表型，以响应周围微环境的变化，参与各种肝脏疾病和损伤，是抵抗细菌和病毒入侵的第一线防线。根据KC 表型及功能的不同，可以将KC 分为促炎性M1 型和抗炎性M2 型。M1 巨噬细胞主要发挥抗原提呈功能，具有促炎、清除致病微生物和抗肿瘤作用，而M2 巨噬细胞具有抑制炎症、促进组织重塑、防止寄生虫感染以及参与血管生成、免疫调节和肿瘤进展的生物学功能。因此，它们通常在许多疾病的发生和发展中发挥相反的调节作用。

在疾病的发生和消退过程中，KC 的极化似乎是一个中间过程，它首先被某些信号激活，产生不同的表型，从而通过作用于多种信号通路发挥调节作用。KC 极化在肝脏疾病的发生发展中起着重要作用，并对各种肝脏疾病具有双重调节作用。在IRI 的早期，肝巨噬细胞以M1 型为主，促进炎症的发生，而在IRI 的后期，肝巨噬细胞以M2 型为主，促进组织修复。事实上，与KC 极化相关的机制是非常广泛的，大多数因素诱导巨噬细胞极化涉及多个信号通路的共同调控，这可能是KC 极化在肝脏疾病中发挥多重作用的重要因素。

动物实验表明，通过抑制M1 型巨噬细胞极化或者调节KC 极化为M2 型可以减轻肝IRI，但并未在大型动物及人类进行相关研究报道。未来的研究将需要更加详细分析肝KC 分化状态及其功能特性，从而深入了解KC 的极化、招募、功能及作用机制，实现KC M1/M2 表型、数量和分布的可控性，为减轻肝IRI 提供新的方法。同时，由于大多数研究是在动物模型中进行，下一步的关键挑战将是将这些新的先天细胞功能概念整合到人类移植受者肝IRI和一般无菌炎症的背景中。这种新颖的方法具有极高的应用前景。总之，在肝IRI 中，KC 是一种十分具有吸引力的治疗靶点，由于其具有改善肝IRI 的潜力，值得进一步研究。