安徽省两栖动物新记录种——秉志肥螈

黄平倩， 汪帆， 鲁航， 荣鹏， 肖祥寅， 张方， 黄松， 吴孝兵， 李冰欣 ， 陈进民

（安徽师范大学生命科学学院，重要生物资源保护与利用研究安徽省重点实验室，安徽 芜湖 241000）

肥螈属PachytritonBoulenger， 1878 隶属两栖纲Amphibian有尾目Caudata蝾螈科Salamandridae，是中国的特有类群，主要分布于我国长江以南的亚热带地区，包括浙江、江西、福建、安徽、湖南、广东、广西和贵州等，栖息于山区森林溪流中（中国两栖类，2022）。目前，肥螈属已知10 种，除秉志肥螈P. granulosus和黑斑肥螈P. brevipes外，其他8 种均为近10 余年发表的新物种（Liet al.，2018；Frost，2022；中国两栖类，2022）。

安徽省的肥螈属目前已知费氏肥螈P. feii1种（Frost，2022；中国两栖类，2022），其是2011 年根据安徽黄山标本命名的新物种，目前分布于安徽南部及其相邻的江西东北部地区（Nishikawaet al.，2011；Wu & Murphy，2015）。本研究在安徽省黄山市休宁县马金岭自然保护区发现秉志肥螈，为安徽省两栖类新记录，此次发现为进一步探讨肥螈属同域物种分化提供了素材。此外，本研究将秉志肥螈的分布区域拓展至白际山脉，为肥螈属的生物地理学研究提供了基础资料，对皖南及其周边地区生物区系与地质史研究具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

6 号肥螈标本（3♂3♀）于2022 年7—8 月采自安徽省黄山市休宁县马金岭自然保护区（118°18′28.42″E，29°31′56.33″N，海拔445 m）。经安乐死后，取肝脏组织保存于95%乙醇溶液中；整体标本以10%甲醛溶液固定后，清水冲洗，75%乙醇溶液保存。标本及组织样品现均保存于安徽师范大学（ANU）。

1.2 形态鉴定与测量

形态测量指标和外部形态描述主要参考费梁等（2012）、Wu 等（2012）、Yuan 等（2016）、Li 等（2018）的方法。用电子游标卡尺测量标本的24个形态指标（精度0.1 mm）：头体长、尾长、头长、头宽、头高、吻长、眼径、眼间距、鼻眼距、鼻间距、肩宽、前肢长、后肢长、尾宽、尾高、第一指长、第二指长、第三指长、第四指长、第一趾长、第二趾长、第三趾长、第四趾长和第五趾长。

1.3 DNA提取、扩增及测序

使用常规酚/氯仿抽提法（Sambrooket al.，1989）提取样品基因组DNA 后，−20 ℃保存备用。参照Wu 等（2010）的方法进行cyt b基因片段的PCR 扩增和测序。PCR 反应体系为25 μL，反应程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，35 个循环；72 ℃ 5 min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送安徽通用有限公司双向测序。

1.4 分子系统发育研究

使用DNASTAR LASERGENE 7.0（Burland，2000）的SeqMan 对测序获得的双向序列峰图进行正反链互补和人工校对。将获得的新序列在Gen⁃Bank上进行BLAST 分析，然后搜索序列同源性，确保新获得的序列是目标DNA 片段。确认后在Gen⁃Bank 中下载肥螈属所有物种cyt b基因的代表序列，并以东方蝾螈Cynops orientalis和棕黑疣螈Tylototriton verrucosus为外群（表1），使用MEGA 7（Kumaret al.，2016）比对序列。使用贝叶斯法（BI 法）和最大似然法（ML 法）同时构建系统发育树。利用JModelTest 0.1.1（Posada，2008）基于AIC标准选择最适核苷酸替代模型。运用MRBAYES 3.2（Ronquist & Huelsenbeck，2003）构建BI 系统发育树，共运行2 000 万代，每1 000 代进行1 次抽样。通过Tracer 1.7（Rambautet al.，2018）中的有效样本量判断结果是否收敛。基于收敛的情况，舍弃前25% 代数。运用RaxML（Stamatakis & Hoover，2008）构建ML 系统发育树，进行1 000 bootstrap 重抽样分析。肥螈属物种间的遗传距离采用MEGA 7基于P-distances距离模型进行计算。

表1 样品信息表Table 1 Information of samples used in this study

2 结果

2.1 形态描述

标本经形态测量（表2）和检视，均符合秉志肥螈的鉴定特征。体型肥壮；头呈椭圆形、扁平，侧面无棱脊，头宽小于头长；吻部较长，端圆；鼻孔小且距离吻端极近，吻长大于鼻间距、鼻眼距；咽喉部有纵褶肤，颈部有明显的褶皱；唇褶发达，上下颔有细齿，犁骨齿列呈“Λ”形，枕部有“V”形隆起，但不明显。皮肤光滑，躯干至尾基部呈圆柱状；背腹略扁平，脊背部位没有隆起而略成纵沟；肋沟11 条左右，部分个体身体两侧有细的横皱纹，腹部有横皱沟。

表2 安徽马金岭自然保护区的秉志肥螈标本的形态量度Table 2 Measurements of Pachytriton granulosus collected from the Majinling Nature Reserve， Anhui

头体、四肢背面褐色，无黑色斑点；头体腹面橘红色，有少数不规则的褐色短纹或呈蠕虫状斑；四肢腹面、肛孔，以及尾巴下缘、尾巴腹面橘红色（图1）。尾基部宽厚，后半段逐渐侧扁，末端呈钝圆状，尾部有细的横皱纹，尾背鳍褶达体背前方；雄性肛部有明显隆起，肛孔纵长，内壁有乳突；雌性肛部隆起不显著，肛孔较短，内壁无乳突。四肢粗短，前肢比后肢短且细。指长顺序为3>2>4>1，第一指较其他指短小；趾长顺序为3>4>2>5>1，第一趾和第五趾较其他趾短小；指趾末端均具缘膜，无角质鞘（图2）。

图1 安徽马金岭自然保护区的秉志肥螈活体照Fig. 1 Pachytriton granulosus from Majinling Nature Reserve， Anhui

图2 安徽马金岭自然保护区的秉志肥螈手（a、 c）与足（b、 d）形态（标本号：ANU000501）Fig. 2 Hand （a， c） and foot （b， d） of Pachytriton granulosus （voucher No. ANU000501）from the Majinling Nature Reserve， Anhui

2.2 分子系统发育分析

cyt b基因序列长1 107 bp。基于BI法和ML法构建的系统发育树拓扑结构基本一致（图3）。本次采自安徽省黄山市休宁县马金岭自然保护区的6号标本属于同一个谱系，与秉志肥螈的样本聚为一支，且得到支持（BPP>95%；BS>70%），该谱系还包括浙江安吉龙王山、浙江台州市天台山、浙江宁海西天目山和浙江淳安金紫尖种群。此外，基于P⁃distance距离模型计算的肥螈属的遗传距离显示，采自安徽黄山马金岭自然保护区的肥螈标本与秉志肥螈的遗传距离最近，与来自浙江宁海西天目山的遗传距离只有0.1%（表3），分子系统学结果支持采自安徽省黄山市休宁县马金岭自然保护区的6号标本均为秉志肥螈。

图3 基于线粒体cyt b基因序列构建的肥螈属贝叶斯系统发育树Fig. 3 Bayesian inference phylogenetic tree of the genus Pachytriton based on mitochondrial cyt b gene

表3 基于线粒体cyt b基因的肥螈属物种间遗传距离Table 3 Genetic distance among Pachytriton species based on mitochondrial cyt b gene

2.3 生境描述

本次采集到的秉志肥螈标本分布在安徽省黄山市休宁县马金岭自然保护区海拔445 m 瀑布下的深水潭里。深潭水流较缓，水质清澈见底，水底多为落叶、石块、泥沙等。水潭分布有小鱼、水生无脊椎动物等小型动物。与其同域分布的两栖类有棘胸蛙Quasipaa spinosa、黄山角蟾Boulenophrys huangshanensis、天目臭蛙Odorrana tianmuii等。植被和水体均保存较好，人为破坏程度较小。

3 讨论

本文结合形态和分子证据揭示了安徽省两栖类新记录种：秉志肥螈，加上之前记录的费氏肥螈，目前安徽省记录有2 种肥螈属物种。形态上，费氏肥螈和秉志肥螈的主要区别在体长、腹面颜色和斑纹等（Nishikawaet al.，2011；费梁等，2012）。在分子系统发育上，秉志肥螈与费氏肥螈存在明显的遗传分化，证实了其形态学的鉴定。

本研究提示肥螈属的物种分布格局值得进一步研究，安徽省肥螈属物种的分布情况有待厘清。秉志肥螈和费氏肥螈可能存在同域共存现象。本研究发现，秉志肥螈分布区之前记录的是费氏肥螈（Wu & Murphy，2015；中国两栖类，2022），这2个物种对栖息环境需求相似，是否存在同域物种分化及其进化机制是未来的研究方向。

本次发现将秉志肥螈的分布区域拓展至白际山脉，为肥螈属的生物地理学研究提供了重要基础资料。秉志肥螈历史记录分布于浙江和福建山区（费梁等，2012；Wu & Murphy，2015）。肥螈属的物种分布格局与山脉水系变迁有着紧密的联系，本发现对于皖南及其周边地区生物区系与地质史研究具有重要意义。