张毕红, 黄棋, 黄岩, 刘耀权, 刘勇*, 王建国*
(1.西北农林科技大学动物医学院,陕西 杨陵 712100; 2.中垦乳业股份有限公司,重庆 401120;3.中国科学院亚热带农业生态研究所,长沙 410125)
血吸虫(Schistosoma)是一种水生寄生虫,可致人畜共患病——血吸虫病(俗称“大肚子病”)。其虫卵寄生于肝脏、肠壁等组织,形成虫卵肉芽肿,最后导致肝脾肿大、肠壁纤维化、肝硬化和腹水等严重的机体非逆性损伤[1]。据世界卫生组织(World Health Organization, WHO)统计,2019年全球有2亿以上人需要获得血吸虫病预防性治疗,经过多年的努力,我国的防控工作取得了巨大进展,但是全国范围内还存在大量的血吸虫流行区、病人以及患病家畜[2]。日本血吸虫是我国动物的主要感染病原,在所有动物中牛的易感性最强,在整个血吸虫病传播链中起到十分重要的作用。作为一种人畜共患病,血吸虫病不仅对我国家畜养殖业造成巨大的经济损失,也对我国居民健康造成严重伤害。本文系统综述了家畜血吸虫病的生长史、传播链和临床症状,分析了血吸虫病的流行病学特征、诊治技术及综合防治方法,以期为血吸虫病的控制和治疗提供指导。
目前全球范围内能够引发血吸虫病的血吸虫有10多种,其中包括日本、湄公河、埃及和间插血吸虫以及几内亚线虫等[3-4]。血吸虫的发育史和寄生史如图1所示,钉螺是整个传播链的中间环节,通过其传播最终感染人和家畜。血吸虫从虫卵到成虫一共需要经历6个阶段,分别是虫卵、毛蚴、胞蚴、尾蚴、幼虫和成虫[5],一般会以毛蚴的形式进入钉螺中进行无性生殖发育成尾蚴,然后排放进入环境中感染人、牛、羊和猪等易感动物,最终在人或牛等易感动物体内发育为成虫进行有性生殖,排卵后再释放到环境感染钉螺[6]。
图1 血吸虫的生活史Fig.1 Life cycle of schistosoma
血吸虫的6个生长阶段中,毛蚴和胞蚴并不会引起机体的免疫反应,不具备免疫原性,但其尾蚴、幼虫、成虫和虫卵进入机体后会引起明显的免疫应答反应,且虫卵在宿主免疫反应中起重要作用。当宿主体内虫卵还未成熟时,其对机体的损害较小,虫卵内毛蚴成熟后分泌的代谢物如酶、蛋白质及糖等物质统称为可溶性虫卵抗原(soluble egg antigen,SEA),该类抗原能够诱导机体产生高水平Th2型免疫应答和特异性抗体[7]。SEA通过虫卵壳上的微孔释放进入机体,诱导T细胞分泌白细胞介素1(interleukin-1,IL-1)、白细胞介素2(IL-2)和γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)等淋巴因子,通过嗜酸性粒细胞趋化因子(eosinophil chemotactic factor, ECF)、成纤维细胞刺激因子(fibroblast stimulating factor, FSF)和巨噬细胞激活因子(macrophage activating factor,MAF)促进巨噬细胞、嗜酸性粒细胞及成纤维细胞聚集,并将虫卵吞噬包裹形成虫卵结节[8]。含毛蚴的成熟虫卵在组织中能存活10 d左右,大部分虫卵会随粪便排出体外,不能排出的虫卵随着时间推移,毛蚴逐渐死亡、机体的免疫反应逐渐降低,虫卵破裂或钙化,最后形成纤维性组织。幼虫入侵体内的症状一般不严重,引起局部的轻度免疫炎症反应。幼虫和成虫也可刺激宿主产生少量抗体,该抗体能抵抗新感染机体的幼虫[9]。
血吸虫感染的发病有急、慢性之分,慢性血吸虫感染会引起肠道尤其是结肠出现病灶,可见嗜酸性粒细胞的数量明显增加;急性感染则会出现高烧的症状,肝脏肿大且按压有疼痛感。血吸虫感染晚期患者会出现全身乏力、厌食和黄疸等症状,检查后可见肝脏和脾脏肿大、肝硬性病变和腹水等现象。易感动物感染血吸虫后,症状和上述类似,其中牛的感染最为常见和严重。临床上会出现食欲消退、消瘦、胃肠道功能障碍、贫血、低蛋白血症和高球蛋白血症等症状,粪便中易检测出虫卵。
急性感染的家畜可能在短期内死亡,慢性感染会导致家畜生长发育迟缓。如牛发生急性感染时会出现高热、贫血、腹泻、食欲不振等症状,检查可见结膜发黄,体温高达40 ℃,以无规则间歇热和稽留热的形式出现[10],慢性感染的病牛临床症状较轻,通常表现出机体消瘦、食欲减退、乏力的症状,有时还可能发生腹泻、血便等病症[11]。对患病家畜进行解剖后可发现明显的贫血症状,皮下脂肪出现萎缩,肝脏病变明显,肿大且存在大量灰白色或者灰黄色的虫卵结节;肠壁增厚,肠黏膜上会出现一些弥漫性出血、存在大量出血点和溃疡的情况,且同样会发现大量结节,内部包含大量虫卵。这些病变发生的主要原因是虫卵在机体的沉积导致周围血管和组织出现炎症甚至坏死。肠壁内的虫卵可引起局部血管阻塞,在SEA和大量炎症因子的作用下出现出血、黏膜水肿、纤维化,肠壁增厚、淋巴结肿大等病理性变化[12]。部分虫卵会通过肠系膜静脉进入血液循环流入肝门静脉,最终停留在肝窦前并随门静脉血流入肝,在汇管处形成急性虫卵结节,故对患病家畜进行病理检查可在肝上发现大量结节状突起,伴随肝细胞变性坏死及色素沉着、肝窦充血、窦间隙增大等。结节附近有嗜酸性粒细胞和单核细胞浸润,门静脉周围大量结缔组织增生,管壁增厚,管腔内形成堵塞[13]。门静脉堵塞会引起其局部高压,组织液回流减少,促使液体从血管和淋巴管渗入或漏入腹腔而形成腹水、巨脾、食管静脉曲张等病理性症状。
全球范围内有超2.4亿人受血吸虫病的影响[14],在热带、亚热带和卫生条件不佳等贫困地区十分常见。目前共有21个国家主动制定相关防疫措施来控制血吸虫病的传播,基本上是采取预防为主,治疗为辅的策略。但依旧存在大量受感染的人群和牛、羊等,血吸虫病的感染风险依旧没有被根除。
自20世纪50年代成立血防办来总领血防工作后,有效地控制了血吸虫病在我国的传播。截至2020年底,原12个流行省份中,云南、湖北、安徽、江西、湖南达到了规定中要求的传播控制标准,四川与江苏则达到了传播阻断标准;上海、浙江、福建、广东和广西基本上都达到了血吸虫病消除标准[2]。
2020年,我国新增了36个县(市、区)达到血吸虫病消除标准,6个县(市、区)达到传播阻断标准,在450个流行县(市、区)中,达到消除标准的比例高达74.89%,达到阻断标准的比例为21.78%,仅3.33%的流行县(市、区)还处于传播控制阶段;我国新增近900例晚期血吸虫病患者,主要分布在湖南、湖北和江西,其中48.78%的新增晚期患者来自湖南省;从全国钉螺面积来看,与2019年的数据相比并无明显变化[15]。在耕牛血吸虫病流行调查方面,2020年,全国流行区内共存栏超54万头耕牛,对部分疫区的耕牛进行血检,阳性率为0.22%[15]。尽管我国的血吸虫病防疫取得了良好的进展,但部分地区血吸虫病传播风险仍然存在,且仍然有零星散在病例发生[16-17]。考虑到血吸虫病流行因素复杂性,要达到血吸虫病根除的目标还有很长一段路要走。
疾病诊断是防治过程中十分重要的环节,目前在血吸虫的诊断方面主要通过病原诊断、免疫学诊断及分子生物学诊断等技术。一直以来,研发出一种简单、安全、有效、特异性强和成本低廉的检测技术是血吸虫病防治的研究重点[18]。
病原诊断通过对粪便进行直接检查,以血吸虫虫卵或毛蚴的检出作为判断标准。常用的诊断法是直接涂片法,通过将粪便样品直接涂片镜检可以检出肠道血吸虫虫卵,但该方法只适用于虫卵含量较高的样品。目前,世界卫生组织(WHO)推荐使用改良加藤厚涂片(Kato-Katz)法对肠道血吸虫进行检测,具有样品需求量少、操作简便、可以定性定量的优点,但其敏感度较低,体内虫卵含量较低时容易出现漏检,目前主要通过提高样品量和制片镜检次数来提高准确率[12]。在虫卵含量较低时,可以采用尼龙绢集卵孵化法对样品中的虫卵进行浓缩以提高检出率,祝红庆等[19]通过比较几种病原诊断方法得出将改良加藤法和尼龙绢集卵孵化法联合使用可以显著提高血吸虫的检出率。虽然由于病原检测存在敏感度较低、不同人员对同一结果判断的主观性较大等原因,该方法漏检率较高且准确性不高,但依旧是血吸虫病诊断的“金标准”[20]。
近年来,由于我国血吸虫病感染率大幅下降,主要疫区也以轻度感染为主,加大了传统病原检测在粪便等样品中检测出血吸虫的难度,由于免疫诊断具备的众多优点,其已成为疫区主要诊断手段,目前较为常用的血吸虫病检测技术有环卵沉淀法(circumoval precipitin test, COPT)、间接血凝法(indirect hemagglutination test, IHA)、酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA)及胶体试纸染色法(dipstick dye immunoassay,DDIA)。
3.2.1 COPT COPT是基于毛蚴进入体内分泌的SEA与特异性抗体结合后形成沉淀的现象,通过对沉淀直径进行观察,如果出现沉淀且直径大于10 μm,则可认定为血吸虫感染[21]。向静等[22]比较了包括COPT、ELISA在内的5种血清学诊断方法与粪检方法在牛日本血吸虫病检测上的灵敏度和准确率,表明COPT是一种较理想的现场普查血吸虫病的方法。该方法敏感度和特异性较病原检测有所提高,但较其他免疫学方法敏感度较低,且试验过程繁琐、对操作者要求高、耗时较长、结果具备一定主观性,在我国家畜血吸虫病检测中应用其实已经十分成熟,目前来说其可以作为一种较好的辅助检测方法。
3.2.2 IHA IHA的检测原理为通过致敏红细胞(附着有SEA的红细胞)与待测血清反应,若血清中包含抗体,将两者相互作用出现的凝集作用作为判断依据。该方法操作便捷、成本低、耗时短、具备较强的灵敏度和特异性的优点,但缺乏稳定性,且其他种类寄生虫的交叉反应也影响了试验的准确性[23]。陈玲等[24]用IHA对286份慢性血吸虫病患者的血清进行检测,发现其敏感度和特异度分别达90.56%和95.45%。左玉婷等[25]认为,IHA常作为病原检测的辅助或者初步筛选方法,且IHA检测阳性率与实际感染率之间存在一定相关关系(r=0.845),在一定程度上可以反映血吸虫感染水平。
3.2.3 ELISA ELISA是基于酶联免疫吸附技术的发展提出的一种诊断血吸虫病的技术,是现在血吸虫病最常用的检测方法之一[26],具有操作便捷、灵敏度高、特异性较强和高重复性等特点。通过对常规方法进行改进,现在已经开发出较多改良的技术,如DOT-ELISA快速诊断试验法[23]、磁珠酶联免疫分析法(IMS-ELISA)[27]等,明显提高了该方法的检测效率,更容易被推广应用。Dot-ELISA以硝酸纤维素膜为固相载体,在具备传统ELISA的优点基础上,该载体在保存、携带和运输方面较为便捷。蔡世飞等[28]研究了rSj26-Sj32融合蛋白在Dot-ELISA检测血吸虫患者的IgG中的应用,并表明其可替代SjAWA用于慢性日本血吸虫病的免疫诊断。沈定文等[29]对比了常规ELISA、Dot-ELISA技术和粪便检测在日本血吸虫病诊断中的效果,发现Dot-ELISA技术和常规ELISA在诊断敏感性和特异性方面相似,均优于粪便检测,具有一定的实用诊断价值。IMS-ELISA利用免疫磁珠与目标物质结合后会带磁性的特性进行检测。近年来,磁珠酶联免疫分析法在血吸虫检测中也得到了一定程度的应用,Yu等[30]通过制备Sj14-3-3蛋白用于IMS-ELISA,并对比了与常规ELISA的效果,该方法检测敏感性较高,与ELISA相比,此法更方便、快捷。
3.2.4 DDIA DDIA是利用染料标记血吸虫SEA进行检测,染料与血清的反应结果通过条带显示出来[31]。DDIA具有灵敏度和准确率高、不易发生交叉反应、耗时短和成本低廉等优点,除了DDIA外,常用在血吸虫病诊断中的试纸法还有乳胶微球标记法、胶体金免疫层析法等[32]。朱荫昌等[33]通过比较尼龙绢集卵孵化法、ELISA、COPT和DDIA等方法在血吸虫病检测中的敏感性、特异性和阳性符合率,得出DDIA可检出绝大多数的感染者,具备较高的敏感性和特异性,且与ELISA和COPT方法相比,在仪器要求和所需时间方面具备较大的优势,适用于血吸虫病的大规模现场应用和普查。Xu等[34]用SEA制备了一种检测血吸虫病的DDIA,具备较高的特异性、敏感性及较低的交叉反应。卢福庄等[35]利用兔抗牛IgG和羊抗兔IgG检测SEA,建立了一种牛日本血吸虫病的DDIA。许瑞等[36]利用胶体金标记重组蛋白G,制备了用于家畜血吸虫病检测的胶体金免疫层析试纸条。
虽然几种免疫学诊断技术逐步在家畜血吸虫病诊断中占据越来越重要的地位,但其只能作为一种初步筛选的工具,不能作为确诊的依据。粪便病原学检测是家畜血吸虫病确诊的“金标准”,但我国血吸虫病感染率和感染程度大大降低后暴露了其敏感性较低的问题。随着核酸检测技术的发展,研究人员通过检测血吸虫核酸的方法来诊断家畜血吸虫病,为家畜血吸虫病诊断开辟了新途径。核酸检测一般通过PCR技术实现,具有高敏感性和特异性[37]。常规PCR在家畜血吸虫诊断中的研究应用相对成熟,如Xia等[38]通过常规PCR扩增患病家兔的粪便和血清中逆转录子SjR2的一段序列,建立了一种特异性PCR检测兔粪便和血清样品中日本血吸虫DNA的特异性PCR检测方法,敏感性可达0.8 pg。
通过对常规PCR的改良,发展出了一系列敏感性和特异性更高的PCR方法,目前,多种改良PCR方法如巢式PCR(nested PCR)、实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)和环介导等温核酸扩增PCR(loop-mediated isothermal amplification PCR, LAMP-PCR)等也在血吸虫诊断中应用[39]。Espírito-Santo等[40]比较了COPT、Kato-Katz和RT-PCR在检测血清和粪便样品中血吸虫的效果,证实通过qPCR检测血吸虫的可靠性。PCR技术在检测血吸虫病中具备较高的敏感性、特异性和精准度,但对试验环境和仪器要求高、需要专业人员操作、耗时长、成本较高。LAMP主要应用在血吸虫病的早期诊断,Xu等[41]建立了一种基于LAMP的血吸虫检测方法,发现其对家兔粪便和血清的血吸虫检测敏感性是常规PCR的1万倍,表明LAMP在家畜血吸虫病检测中具备广阔的应用前景,但其检测时易受到污染,假阳性概率高,对检测环境和检测人员具有较高的要求,不适合在基层或者养殖场进行推广应用。
近年来,把核酸扩增技术和试纸条结合,使检测结果可视化的方法在家畜病原微生物检测中应用越来越广泛,根据试纸条条带的显色情况即可检测出有无目的片段存在,该方法操作简便、不需要其他特殊仪器辅助、敏感性高,更适合对家畜血吸虫病现场快速筛查和诊断的要求。叶钰滢等[42]结合重组酶介导的等温扩增技术(recombinaseaided isothermal amplification assay, RAA)和核酸试纸条技术建立了一种敏感性较高的快速检测日本血吸虫特异性基因片段的方法,该方法在血吸虫检测中效果良好,但由于开放的检测环境导致其也存在交叉污染的可能性,后期应在此方面进行优化提高检测准确度。
随着各学科的飞速发展与交叉,新型材料在医学检测和化学技术中的应用越来越成熟,研究者将传感器与免疫反应相结合,构建出了一种新的血吸虫病检测技术,充分结合了传感器的高灵敏度和免疫反应的高特异性,具备十分广阔的发展空间。现在在血吸虫病检测上应用的主要有电化学免疫传感器和光学免疫传感器。电化学免疫传感器在免疫传感器中研究开发的较早,具有技术成熟、识别精度高、制备简单等特点,已经在血吸虫病检测上得到应用[43-45]。
光学生物检测技术特别是纳米金标记技术已经成为免疫学四大标记技术之一,纳米金优良的理化特性使得其制备光学免疫传感器上广泛应用。通过构建固相金纳米棒光学免疫传感器,能够有效地检测各种时间段特别是早期血吸虫病感染[46]。传感器在血吸虫病检测中的应用不仅可以作为一种常规的检测手段在大规模筛查中应用,还可与其他方法结合去诊断早期血吸虫病。
血吸虫病在我国已有两千多年历史。20世纪50年代至今,在国家的大力支持下,通过大规模的家畜血吸虫病调查,基本上调查清楚了我国家畜血吸虫病在各流行地区流行状况。牛、羊、猪等家畜是血吸虫的易感动物且在血吸虫病传播链中占据重要地位,因此在防治家畜血吸虫病方面,应将重点放在控制传播上。通过建立监测体系、开发治疗药物和疫苗及农业综合治理等手段,我国家畜血吸虫病防治取得了阶段性的成功。目前我国家畜血吸虫病主要以牛、羊为主,防控重点地区为洞庭湖湖区、鄱阳湖湖区以及长江洲滩,感染率和感染强度持续下降[47]。
监测是血吸虫病防治的重要环节,监测工作的有序推进能够保障制定防治规划、评估防治效果和调整防治策略等环节的实施,共同推进我国血吸虫病防治进程[48]。初期,我国血吸虫病的监测只能覆盖一些重点地区,监测内容也只有简单疫情监测。随着监测体系的不断完善,监测内容也不断地丰富,起初重点监测人和畜患病情况及螺情,以疫情动态和流行态势的监测为主,2005年起将洪涝等自然灾害因素、流动人口血吸虫感染、经济等社会和自然因素纳入监测范围;2015年,我国将传播风险监测纳入监测内容,实现监测内容和检测技术因地制宜,并将国家监测点覆盖了重灾疫情和潜在疫情县(市、区)[49]。2020年,监测模式由固定监测点转变成流动监测点,进一步扩大监测范围,加入风险评估系统。总的来说,现在我国已经形成集监测、预警、风险评估等环节的完备血吸虫监测系统。但随着血吸虫流行态势的变化,新时代血吸虫病监测系统必需不断完善,如进一步加强网络平台建设、完善监测网络,进一步加强新技术的研发投入和信息化建设,健全监测预警体系、提高数据分析能力,提高监测系统的敏感性和时效性,结合云平台、大数据等技术,不断完善监测系统。
化学药物治疗可以有效杀灭血吸虫虫体,是血吸虫病防治的重要技术手段和措施。其中,吡喹酮是有效的血吸虫病治疗药物,治疗效果显著且毒副作用小,但其只能针对幼虫和成虫阶段的血吸虫,无法控制患者重复感染且不能起到预防的作用。由于目前暂无有效的替代药物,其耐药性问题一直得不到解决,因此需要开发出一种有效的疫苗来预防血吸虫病的感染和传播,将疫苗和药物治疗相结合,共同推进血吸虫病防治。
血吸虫病疫苗经历了从灭活疫苗、致弱活疫苗到DNA疫苗、基因工程疫苗等分子疫苗的过程,最初主要是致力于通过射线处理致弱尾蚴和幼虫,以及不同阶段血吸虫虫体的分离和抗原分泌物的疫苗研究开发,但由于虫体来源、保存运输和疫苗安全性等无法保障,制备成本较高,限制了其大规模应用。相较于致弱活疫苗和灭活疫苗,DNA疫苗在安全性、稳定性方面都有较好的表现,既继承了致弱活疫苗的优点,又弥补了其不足的地方,谭潇等[50]研究表明,血吸虫表膜蛋白SjOST48 DNA疫苗能够诱导机体产生高水平的免疫反应,显著提高机体对血吸虫感染的抵抗力,但疫苗的稳定性和安全性还需要进一步的提高。所以通过基因工程手段制备血吸虫疫苗逐渐成为主流方法,通过筛选、分离血吸虫SEA和表膜蛋白相关基因,利用表达载体生产重组抗原,以此来制备血吸虫疫苗。但由于血吸虫的逃避作用,以及单一重组抗原制备的疫苗很难针对不同时期的虫体产生保护性,如何在保证安全和稳定性的前提下提高疫苗的保护性就显得十分重要,如可以通过多种重组抗原联合的方式制备疫苗。
对我国家畜血吸虫防治来说,主要通过吡喹酮治疗和患病家畜灭杀等措施来控制疾病传播。作为一种水生寄生虫,血吸虫的传播与钉螺和易感家畜密切相关,通过优化农牧业形式,改变传统种植方式来降低水田养殖的比例,减少钉螺滋生,同时降低疫区家畜饲养比例,转为家禽等非易感动物养殖,在降低家畜感染率的同时保证一定的经济发展。
据调查,我国已于2019年底基本实现了阻断血吸虫病传播的目标[2]。虽然血吸虫病流行现象已经得到有效控制,但依旧存在传染源控制困难、钉螺消灭难等问题,且洪涝灾害、人畜之间的频繁接触等都可能会导致家畜血吸虫病疫情反弹甚至再次暴发[51],风险防控工作依旧不能松懈[52]。
除了牛、羊等主要易感动物外,众多哺乳动物亦是血吸虫的保虫宿主从而传播血吸虫病,再加上部分地区存在野生动物作为传染源导致疾病传播的现象,而目前还未针对野生动物建立血吸虫的监测管理系统,影响了我国以控制传染源为主要目的的综合防治。作为血吸虫病传播链的关键环节,钉螺控制一直是我国血吸虫综合防治的着力点,也取得了一定成效,但由于环境复杂且洪涝灾害频发,残余的钉螺消灭难度加大,严重阻碍了我国血吸虫病防治工作的推进。因此,未来应结合我国家畜血吸虫病流行现状,加大对家畜血吸虫病快速检测技术、钉螺控制和检测技术、治疗药物和疫苗开发等基础研究的投入,了解目前家畜血吸虫病防治的瓶颈,在巩固防治成果的同时,力争突破瓶颈,为加快推进我国血吸虫病全消除奠定基础。
目前,我国在血吸虫病检测技术和疫情大数据管理上存在一定局限性,且血吸虫病防治相关的法规有待更新修订,随着国家疾病预防控制局的成立,我国疾病预防控制体系改革的大幕被正式拉开。国家疾病预防控制局计划围绕传染病防控和应急处置的核心职能,强化监测预警、风险评估、流行病学调查、检验检测、应急处置和监督监管等主要职能[53]。基于此,在血吸虫综合防治方面,应该积极响应国家疾病预防控制体系改革的相关政策,落实“稳优势、可持续、补短板、强弱项”,除了强化上述主要职能方面的重要能力建设,还应该将智能化、自动化、信息化和大数据与血吸虫相关各项工作结合起来,加强科研能力建设,科学有效地应对在血吸虫病防治过程中出现的各种问题,最大程度地预防或降低血吸虫病突发疫情造成的危害。
总的来说,目前我国血吸虫防治工作已经进入了“稳中求进”的新阶段,需要加强和完善家畜血吸虫防控体系的构建,严格按照国家和地方的防控要求,及时解决各种可能存在的风险因素,做好疫情重灾地区的风险评估并及时采取有效措施。加大对家畜血吸虫病防控技术和产品的投入和研发,加强血吸虫病的科普宣传教育,为消除血吸虫病提供保障[54]。力争以科技创新为驱动力,通过控制传染源、掐断传播途径等途径推动家畜血吸虫病综合防治进展。