卵巢癌治疗中PARPi耐药机制及克服策略

陈李纲,高云鸽,董 健,翟梁好,王明义,吕小慧,陈必良

(1.空军军医大学第一附属医院妇产科,陕西 西安 710032;2.中国人民解放军西部战区总医院妇产科,四川 成都 610036)

卵巢癌是治疗最困难的女性生殖道恶性肿瘤,因发现晚、易复发、易耐药,晚期卵巢癌的5年生存率不足30%。卵巢癌患者经过以R0为目标的肿瘤细胞减灭术、以铂为基础的规范化疗后,继续使用聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂(poly ADP ribose polymerase inhibitor,PARPi)维持治疗可延缓复发并延长无进展生存(progression-free survival,PFS)时间。随着PARPi的广泛应用,PARP抑制剂的耐药问题日益突出,因此,阐明PARP抑制剂的作用机制、耐药机制,寻求更好的解决耐药问题的策略,才能使晚期卵巢癌患者更多获益。

1 PARPi的作用机制

PARP酶家族包含17个成员,其中PARP1占80%以上,在DNA单链损伤(SSB)修复中发挥重要作用。PARP1能及时识别并结合SSB,通过水解烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+),将二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)核糖部分填加至PARP1和组蛋白等底物蛋白,使底物蛋白发生核糖基化修饰(PAR化),进而导致染色质松弛和DNA修复酶如XRCC1的募集,启动SSB修复反应[1-2]。

同源重组(homologous recombination,HR)修复途径以同源序列作为修复模板,是一种准确且高保真的双链DNA断裂(DSB)修复方式。在HR修复过程中,乳腺癌易感基因(breast cancer,BRCA)1和BRCA2通过促进DNA末端切除、促进重组酶在DSB位点募集,发挥了非常重要作用。PARPi主要以两种机制发挥作用,一方面,PARPi通过合成致死发挥作用:在BRCA1/2突变细胞中,PARPi抑制PARP1活性,导致大量未修复SSBS累积,进而促进停滞复制叉坍塌,导致DSB增多,由于BRCA1/2突变引起同源重组修复缺陷(homologue recombination deficient,HRD),大量DSB由容易出错的非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)途径修复,导致基因组不稳定,随后导致细胞死亡[3]。另一方面,PARPi通过阻止PARP1自体PAR化和诱导变构调节来阻碍PARP1与DNA的解离,将PARP1捕获在DNA上,阻碍复制叉进程,最终导致有丝分裂过程中染色质的异常形成和细胞死亡[4]。

2 PARPi耐药机制

2.1 HR恢复

2.1.1 BRCA1/2的回复突变

肿瘤细胞通过回复转突变恢复BRCA1/2的功能是常见的PARPi耐药机制。四川大学华西第二院对5例接受PARPi维持治疗出现耐药的晚期卵巢癌患者活检样本进行高通量测序(next generation sequencing,NGS),发现1例患者治疗前为BRCA1突变,耐药后检测到BRCA1发生回复突变。另一项对携带BRCA1/2突变的泛癌研究中,含铂化疗及PARP抑制剂治疗后进行组织基因检测,在86例(26%)患者中发现BRCA1/2回复突变[5-6]。

2.1.2 BRCA1启动子高甲基化的缺失

BRCA1启动子的高甲基化导致BRCA1 mRNA表达下调,10%～20%的浆液性卵巢癌BRCA1功能缺失与启动子区CpG岛的高甲基化相关[7]。在卵巢癌患者异种移植物(patient-derived xenografts,PDX)模型中发现,BRCA1启动子甲基化缺失,使BRCA1重新表达HR途径恢复,进而产生对PARPi耐药[8-9]。

2.1.3拮抗DNA末端切除分子缺失

HR途径的激活需要切除5′端的DNA产生一定长度的3′悬垂,p53结合蛋白1(53BP1)、Rap1 相互作用因子1(Rap1-interacting factor 1,RIF1)、Shieldin复合物(SHLD1、SHLD2、SHLD3、Rev7)保护5′端不被切除,限制3′悬垂的形成。此外,Shieldin复合物招募端粒结合蛋白复合物及相关的DNA聚合酶α/引物酶(POLα/引物酶),通过填充合成来限制3′悬垂形成[10-11]。此外,动力蛋白轻链1(dynein light chain 1,DYNLL1)通过抑制核酸酶MRE11活性,DNA解旋酶B(HeLB)通过抑制核酸酶EXO1和BLM-DNA2活性也同样发挥拮抗DNA末端切除的作用。故以上抑制DNA末端切除分子的缺失可恢复BRCA1缺陷细胞的HR途径,产生对PARPi的耐药性[12-14]。

2.1.4 RAD51过度表达

BRCA1-BRCA2-RAD51轴是 HR的关键。细胞内RAD51水平通过早期有丝分裂抑制因子1(early mitotic inhibitory 1,EMI1)介导的降解得以控制。在BRCA1缺失的三阴型乳腺癌细胞中下调EMI1,可恢复依赖RAD51的HR,产生对PARPi的抗性[15]。在卵巢癌PDX模型研究中发现,RAD51病灶的基础水平与奥拉帕利反应强烈呈负相关,病灶评分越低,对奥拉帕利的敏感性越高[16]。

2.1.5微同源介导的末端连接修复途径过度激活

微同源介导的末端连接(microhomology-medi-ated end joining,MMEJ)修复途径在正常哺乳动物细胞中很少使用,而在癌症中普遍上调,尤其是在HRD癌细胞[17]。DNA聚合酶θ(Polθ)是MMEJ修复途径的关键酶,在HRD的癌细胞中,Polθ过度表达使MMEJ修复途径过度激活,修复损伤DSB[18]。此外,通过ctDNA测序分析卵巢癌或乳腺癌患者治疗进展前后的血浆样本,发现68%的BRCA回复突变是由MMEJ途径介导的[19],故MMEJ途径与PARPi耐药密切相关。

2.2复制叉稳定性恢复

高级别浆液性卵巢癌(high-grade serous ovarian carcinoma,HGSOC)是高复制应激肿瘤的典型代表。复制应激中停滞的复制叉由转位酶SMARCAL1、ZRANB3和HLTF激活核酸酶启动复制叉重塑来维持基因组稳定性[20]。转位酶SMARCAL1、ZRANB3和HLTF的丢失或核酸酶MRE11/EXO1、核酸内切酶EZH2/MUS81的活性降低,都会相对增加复制叉的稳定性而引起PARPi耐药。此外,X染色体上RPA相关RAD51拮抗蛋白(RPA-related,RAD51-antagonist on X-chromosome,RADX)通过调节RAD51活性参与复制叉保护,RADX的缺失为BRCA1/2、FANCA、FANCD2或BOD1L基因缺失的细胞提供复制叉保护,引起PARPi耐药[21-22]。

2.3 PARP1捕获减少

如前所述,PARPi发挥作用的一条重要途径是将PARP1捕获在DNA损伤位点,阻碍复制叉进程,最终导致HRD肿瘤细胞死亡。故PARP1突变引起捕获减少,可引起PARPi耐药。通过CRISPR-Cas9技术对PARP1进行全基因组测序发现,PARP1突变引起PARP1的捕获减少,导致PARPi在BRCA1突变型三阴型乳腺和卵巢癌细胞中的毒性降低。此外,一名患者因PARP1突变导致PARP1从受损DNA位点迅速解离,而对奥拉帕利产生耐药[23-24]。

PAR糖化水解酶(poly ADP ribose glycohydrolase,PARG)是降解PAR链的主要酶,PARG的缺乏也可以使PARP1捕获相对减少。PARG的缺乏使PARP产生的高负电荷PAR链不能被降解,促进了其从DNA上的释放从而减少了PARP1捕获。在细胞试验中,通过shRNA介导PARG丢失导致小鼠乳腺肿瘤细胞对奥拉帕利和AZD2461的耐药性增加。对临床肿瘤标本检测发现,PARG丢失的HGSOC细胞对PARPi具有耐药性[25]。

2.4药物外排增加

多药耐药基因1(MDR1)编码的P-糖蛋白的表达增加是耐药的公认机制之一[26],P-糖蛋白利用ATP水解的能量,将有毒化合物转移至细胞外,从而对多种药物产生抗性。对由MDR1表达增加引起的耐药研究发现,紫杉醇耐药A2780卵巢癌细胞对奥拉帕利和卢卡帕利具有交叉耐药性,但对维利帕利或AZD2461不具有交叉耐药性,在使用MDR1抑制剂维拉帕米和依克立达治疗后耐药性是可逆的[27]。

2.5细胞周期依赖性激酶12过度表达

细胞周期依赖性激酶12(CDK12)表达水平可以影响细胞对PARPi的敏感性。用CDK12 shRNA沉默奥拉帕利耐药卵巢癌细胞株OV90中CDK12的表达,结果发现奥拉帕利敏感性显著增加,增加程度与沉默BRCA1相当。同时,恢复CDK12低表达的肿瘤细胞系CAOV3中CDK12表达,显著增加了对奥拉帕利的耐药性。细胞周期蛋白K(Cyclin K)是CDK12的细胞周期蛋白伴侣,负责调节CDK12的表达,沉默Cyclin K与沉默CDK12效果相同。因此,CDK12或Cyclin K在肿瘤细胞中的过度表达与PARPi耐药相关[28]。

2.6微小RNA表达异常

miR-622在S期通过下调Ku复合物表达抑制NHEJ,并促进MRE11的募集促进S期HR介导的双链DNA损伤修复的启动,异位过表达miR-622可以诱导BRCA1突变HGSOC对PARPi和铂类药物耐药[29]。miR-182在BRCA1的表达方面起着重要作用,拮抗miR-182表达通过上调BRCA1表达增强了HR能力,从而使细胞对PARPi产生抗性[30]。miR-493-5p表达增加介导BRCA2突变肿瘤对PARPi耐药。不同于miR-622和miR-182,miR-493-5P不改变同源重组的能力。miR-493-5P在BRCA2突变肿瘤内的表达降低了核酸酶活性,从而导致了相对稳定的复制叉,仅在携带BRCA2突变的肿瘤细胞中诱导对PARPi的耐药性[31]。

3可能克服PARPi耐药的策略

3.1 PARPi联合同源重组途径抑制剂

针对因同源重组恢复引起的PARPi耐药,联合使用同源重组途径抑制剂可能逆转PARPi耐药。RNF168抑制剂阻断了BRCA1非依赖性PALB2/BRCA2募集,提高了因丢失53BP1-RIF1-Rev7-Shieldin末端保护途径而对PARPi耐药的BRCA1突变型肿瘤再次对PARPi的敏感性[32]。KIAA1529通过极光激酶A(Aurora-A)增加下游效应子RAD51的表达,使HR在卵巢癌细胞中得到恢复,联合KIAA1529抑制剂可逆转因RAD51过表达引起的PARPi耐药[33]。此外,第10染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10,PTEN)缺失通过抑制RAD51的表达抑制HR,联合PTEN抑制剂也可发挥上述作用[34]。Polθ抑制剂ART558抑制Polθ介导的MMEJ修复途径,促进BRCA1/2突变肿瘤细胞的DNA损伤和合成致死性,联合Polθ抑制剂可逆转因MMEJ修复途径过度激活引起的PARPi耐药,而且对53BP1/Shieldin复合物缺失诱导的PARPi耐药也有一定效果[35]。热休克蛋白90抑制剂17-AAG通过抑制HR,增强对奥拉帕利的敏感性,与单独使用奥拉帕利相比,17-AAG联合使用奥拉帕利可诱导更多的双链DNA损伤[36]。溴结构域和超末端结构域(BET)抑制剂JQ1通过抑制BRCA1的表达而阻断HR途径,与PARPi联合使用可克服肿瘤细胞对PARPi的耐药性并提高PARPi的疗效[37]。

3.2 PARPi联合细胞周期检查点抑制剂

细胞周期检查点可分为DNA损伤检查点(ATM-CHK2-P53)和DNA复制应激检查点(ATR-CHK1-WEE1),负责监视细胞周期G1/S期和G2/M期的转换。恶性肿瘤细胞高度依赖DNA复制应激检查点通路处理本身的高复制应激,HGSOC就是高复制应激肿瘤的典型代表。ATR-CHK1-WEE1通路抑制剂抑制S期和G2/M细胞周期检查点,使恶性肿瘤细胞提前进入有丝分裂期,从而增加DNA错误的数量,导致基因组不稳定,有丝分裂突变增多,与PARPi联合使用可以产生协同作用。

ATR通过与PARP的相互作用引起G2/M细胞周期阻滞和保持复制叉稳定。此外,ATR可绕过BRCA1,通过磷酸化复制蛋白A向DSB招募PALB2和BRCA2,参与HR的恢复[38]。在PARPi耐药的BRCA1/2缺乏的HGSOC细胞株中观察到ATR的过度表达,联合ATR抑制剂AZD6738使耐药细胞对PARPi再敏感[39]。在一项评估口服ATR抑制剂M6620在晚期难治实体瘤患者中应用的Ⅰ期试验中,1例对铂类及PARPi耐药的BRCA1突变卵巢癌患者,口服M6620后获得部分应答,CA125水平相应降低[40]。

CHK1除了参与G2/M细胞周期阻滞外,还通过促进BRCA2-RAD51磷酸化参与DSB的修复。在奥拉帕利耐药PDX模型中,CHK1抑制剂Prexasertib与奥拉帕利联合使用具有协同作用,可显著抑制肿瘤生长;在奥拉帕利敏感PDX模型中,增强了反应的程度和持久性[41]。在PARPi耐药的HGSOC患者中进行了Prexasertib与奥拉帕利的联合试验,其中18例患者中有4例获得部分缓解[42]。

WEE1通过磷酸化抑制CDC25C,进而导致CDK2和CDK1缺失,引起G2/M期阻滞。一项Ⅱ期临床研究在复发性PARPi耐药卵巢癌患者中评估WEE1抑制剂Adavosertib联合或不联合奥拉帕利的疗效。总体反映率分别为23%、29%,中位PFS分别为5.5个月、6.8个月。其中野生型BRCA1/2患者,单一治疗组的总体反映率为31%,联合治疗组为39%[43]。在卵巢癌PDX中还发现相较于同时给药,序贯给药对正常细胞影响较小,毒性较低,疗效相同[44]。

3.3 PARPi联合免疫检查点抑制剂

PARPi通过释放DNA颗粒到细胞质中激活环GMP-AMP合酶(cyclic GMP-AMP synthase,cGAS)-干扰素基因刺激物(stimulator of interferon genes,STING)通路。cGAS-STING通路的激活一方面可以引发先天免疫应答,另一方面还能上调细胞程序性死亡配体1(programmed death ligand-1,PDL1)的表达。因此,将抗PD1或PDL1的单克隆抗体与PARPi联合使用,可增强对肿瘤细胞的杀伤作用[45],但对PARPi耐药的患者是否可以从这种联合治疗中受益还有待进一步临床试验确定。

3.4 PARPi联合ALK抑制剂

间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)磷酸化CDK9,促进HR和PARPi耐药。分别在卵巢癌PDX模型和对PARPi耐药的三阴型乳腺癌PDX模型中比较PARPi和ALK抑制剂的单独及联合作用,两种模型结果均为PARPi联合ALK抑制剂用药组小鼠荷瘤大小明显小于单用任何一种药物;与单药治疗的小鼠相比,联合用药组小鼠显示出更好的存活率[46]。因此,联合ALK抑制剂可能是克服PARPi耐药性的一种策略。

3.5 PARPi联合管内皮生长因子受体抑制剂

血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)抑制剂通过诱导BRCA1/2和RAD51的表达下调抑制HR,增加PARPi的敏感性。卵巢癌PDX模型研究表明,联合VEGFR抑制剂Cediranib可提高奥拉帕利对PARPi耐药卵巢癌细胞的杀伤作用[47]。一项Ⅱ期临床试验对单用尼拉帕利组和联合贝伐单抗组治疗铂敏感复发性卵巢癌的疗效进行比较,结果显示联合用药组显著提高PFS(中位PFS分别为5.5个月、11.9个月)[48],联合VEGFR抑制剂是治疗PARPi耐药患者的可行方法。

4结语

虽然以PARPi为主的维持治疗使卵巢癌患者5年生存率较前有所提升,但同其他化疗药物一样,耐药依然是限制卵巢癌患者从PARPi更大获益的瓶颈。目前大量的临床前及临床研究为我们揭示了PARPi可能的耐药机制及逆转PARPi耐药的可行策略,我们仍需继续深入研究不同种类PARPi的确切作用机制及耐药机制,并将研究成果转化为临床应用以保持PARPi持续敏感性。此外,由于大部分患者在接受PARPi前已经接受多周期化疗,肿瘤可能已经对PARPi产生了某些形式的耐药,我们需要研究是否能在肿瘤细胞减灭术后尽早给予PARPi来最大程度地改善患者预后。相信随着研究进展,会出现更多安全有效的方案来预防或推迟耐药的发生,并最终改善患者的长期结局。