党参茎基腐病病原鉴定及其防治药剂的筛选

冯明桥 冯育才 勾伟 雷娇娇 韩继怀 江龙 王尤 汪珊

摘要 ［目的］ 明确贵州省道真县党参茎基腐病的病原及其防治药剂。［方法］ 利用组织分离法和柯赫氏法则进行病原菌的分离和致病性验证，利用形态学与 rDNA－ITS 对致病菌进行鉴定，之后通过大田防治试验测定5种杀菌剂对党参茎基腐病的防治效果。［结果］ 引起道真党参茎基腐病的病原菌为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）；杀菌剂大田防治试验结果表明，50%多菌灵可湿性粉剂对病害的防治效果最佳，病害防治效果为81.63%；25%甲霜灵可湿性粉剂的防治效果次之，防治效果为74.49%；40%乙膦铝可湿性粉剂、65%代森锌可湿性粉剂、70%甲基硫菌灵可湿性粉剂对党参茎基腐病的防治效果较差为30.61%～51.02%。 ［结论］道真大沙河党参茎基腐病的病原为尖孢镰刀菌，50%多菌灵可湿性粉剂对党参茎基腐病的防治效果较好。

关键词 党参；茎基腐病；镰刀菌；病原菌鉴定；防治药剂

中图分类号 S435.672  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2023）13-0132-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.13.031

Identification of the Pathogen of Codonopsis pilosula Stem Base Rot and Screening of Its Control Agents

FENG Ming-qiao，FENG  Yu-cai，GOU  Wei  et al

（Guizhou Dashahe Provincial Nature Reserve Administration Bureau， Daozhen，Guizhou   563500）

Key words ［Objective］ To identify the pathogen of stem base rot of Codonopsis pilosula in Daozhen County， Guizhou Province and its control agents. ［Method］ The pathogenic bacteria were isolated and verified by tissue isolation method and Koch's rule. The pathogenic bacteria were identified by morphology and rDNA ITS， and then the control effect of five fungicides on stem base rot of Codonopsis pilosula was determined by field control test. ［Result］ Fusarium oxysporum was the pathogen causing the stem base rot of Codonopsis pilosula.The field control experiment of fungicide showed that 50% carbendazim wettable powder had the best effect on disease control， and the disease control effect was 81.63%;the control effect of 25% metalaxyl wettable powder was the second， and the disease control effect was 74.49%;40% ethyl phosphine aluminum wettable powder， 65% Daisen zinc wettable powder and 70% thiophanate methyl wettable powder had a poor effect on the stem base rot of Codonopsis pilosula， which was 30.61%-51.02%. ［Conclusion］ The pathogen of stem base rot of Codonopsis pilosula in Daozhen Dasha River was F. oxysporum， and 50% carbendazim wettable powder had good control effect on stem base rot of Codonopsis pilosula.

Key words Codonopsis pilosula;Stem base rot;Fusarium oxysporum;Pathogen identification;Control agents

基金項目 贵州省林业厅2017年林业优秀青年人才培养专项“洛党参病虫害调查及主要病虫害绿色防控技术研究”（黔林科合J〔2017〕15号）。

作者简介 冯明桥（1987—），男，贵州正安人，工程师，从事自然保护区管理及科学研究。通信作者，高级工程师，从事自然保护区科学研究。

收稿日期 2022-08-08

党参（Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.）为桔梗科党参属多年生草本植物，其根性平、味甘，具有补中益气、健脾益肺之功效［1］，还具有免疫调节、改善胃溃疡、抗炎、抗氧化、调节糖脂代谢及抗肿瘤等药理作用［2］。研究表明，党参富含生物碱、聚炔类、木质素类、黄酮类化合物和多糖等活性成分［3］。随着市场需求加大，贵州党参的种植面积不断增加，病害问题日益加重。刘春叶等［4］在贵州道真县洛党参主要病害发生动态中发现了白粉病（Sphaerotheca codonopisi）、根腐病（Fusarium oxysporiums）和锈病（Puccinia campanumoeae）。2021年，首次在道真的党参上发现茎基腐病，为害面积

呈逐年上升趋势，据调查，一般田间发病率为5%～10%，严重的达30%以上，該病害已成为制约当地党参发展的主要因素之一，严重影响了党参的产量与品质，给种植户带来巨大的经济损失［5］。笔者从形态学以及分子生物学对党参茎基腐病病原菌进行分离与鉴定、致病性的检测及防治药剂的简单筛选，为进一步了解道真的党参茎基腐病病害防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试党参来自贵州省道真县阳溪镇阳坝村党参种植基地1年生苗。防治试验所用药剂见表1。

1.2 试验地概况

田间试验在贵州省道真县阳溪镇阳坝村（107°38′2″～107°38′41″E、29°8′18″～29°8′56″N）进行，平均海拔1 550.2 m，月平均气温0.6～22.6 ℃，空气湿度11.2%～77.1%，pH 5.4～6.9。

1.3 病样采集与病原菌分离和纯化

2022年4月在贵州省道真大沙河自然保护区党参生产基地采集发病植株，装入塑封袋带回实验室。采用常规组织分离法，剪取茎基部病健交界处1 mm×1mm 组织块在 75%乙醇中浸泡 5 s，然后转移至1.5%次氯酸钠溶液中消毒1 min，无菌水漂洗3次晾干，置于 PDA 培养基平板内于 25 ℃培养 5～7 d。从菌落边缘切取菌丝块置于PDA 培养基，在25 ℃培养7～10 d。将分离纯化的菌株转接至PDA斜面4 ℃保存备用。

1.4 致病性测定

利用无菌昆虫针挑取PDA培养的疑似致病菌的菌丝，穿刺党参幼苗茎部，后用无菌土掩埋茎基部。每个菌株接种处理30株党参苗，以无菌昆虫针穿刺党参幼苗茎部作为对照。以上接种处理30 d后，观察并记录党参发病情况，统计发病率和病情指数。病情指数根据分级标准进行测定：0级，茎基部没有病斑；1级，茎基部有轻微病斑，病斑面积占 5%；3级，茎基部有病斑，病斑面积占10%；5级，茎基部有严重病斑，病斑面积占25%；7级，茎基部有严重病斑，病斑面积占50%以上［6］。病害发生率和病情指数的计算公式：

病害发生率=发病株数调查总株数×100%

病情指数=（各级发病数×相对应病级）调查总株数×5×100

1.5 党参茎基腐病病原菌的鉴定

参考Weir等［7］方法进行病原菌的形态学鉴定，主要对病原菌菌落特征、颜色、菌丝及孢子大小等进行观察。参考李婕等［8-9］的方法利用rDNA -ITS分子测序对病原菌进行测序，具体方法：首先利用CTAB法提取病原菌总DNA，利用真菌通用引物ITS1（5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′）和 ITS4（5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′）进行序列扩增，PCR扩增体系和反应程序与漆永红等［6］的方法一致。得到序列后通过NCBI的Blast 进行序列的比对分析，同时利用 MEGA 7.0进行包含致病菌 ITS 序列在内的系统进化树，综合形态学与分子生物学的方法进行病原菌的鉴定。

1.6 田间防治试验

设计5个处理，即表1中的5种药剂，清水处理作为对照。每个处理的小区面积为2 m×10 m，每个处理3个重复。于2022年5月试验地有茎基腐病发生时开始药剂喷施，从第1次喷施开始，每隔10 d喷药1次，连续喷药3次。每种药剂的用量为1 500 g/hm2。在最后一次喷药10 d后统计党参茎基腐病的病害发生率和病情指数进而计算防治效果。防治效果计算公式：

防治效果=对照病情指数-处理对照指数对照病情指数×100%

2 结果与分析

2.1 党参茎基腐病致病菌分离及致病性检测

道真党参茎基腐病田间发病症状见图1A。党参茎基腐病发生初期，在茎的基部产生白色的小菌落，腐烂状，向上延伸至叶片周围，叶片感病以后变薄变透明的同时逐渐腐烂，其间叶子渐变成黄绿色。后期茎基和叶片成水渍状瘫软匍匐在地上，直至整个植株稀烂于地上。采用组织分离法由党参茎基部分离获得真菌20余菌株，通过形态学检测发现其中15种属于镰刀菌属（Fusarium spp.）真菌。选取15个镰刀菌属真菌中的5个菌株（DS-1、DS-2、DS-3、DS-4、DS-5）进行党参大田的回接试验，发现5个菌株均可引起党参茎基腐病（图1B）。5个菌株引起党参茎基腐病的病害发生率为85%～92%，病情指数为76～88。其中，菌株DS-4的发病率和病情指数最高分别为92%和88。

2.2 党参茎基腐病病原菌的形态学特征

对回接试验引起发病的5个菌株进行形态学观察，发现其在PDA培养基上的颜色、质地相同，菌丝和孢子一致。在PDA培养基上菌落白色、粉色至紫色。大型分生孢子镰孢形，中间粗，两端尖细，具3～5个横隔膜，多为3个隔，大小为（23.5～32.9）μm×（2.4～3.5）μm，足胞明显。小型分生孢子椭圆形、长椭圆形，单胞，无色，假头状，大小为（3.5～14.1）μm×（1.8～2.9）μm。根据形态特征，查阅真菌鉴定手册，5个引起党参茎基腐病菌株的形态学特征与尖孢镰刀菌（F.oxysporum）一致（图2）。

2.3 病原菌分子生物学鉴定结果

随机选取5个致病菌株的1个进行DNA的提取和rDNA-ITS序列的扩增。结果获得长度为541 bp 的序列。 NCBI 的 Blast 比对结果显示，该序列与 GenBank 登录号为MW760815的F.oxysporum的序列覆盖度为 100%，序列相似性为 100% 。由图3可知，致病菌株的ITS序列与尖孢镰刀菌聚为一类，亲缘关系较近。由此结合形态学与分子生物学鉴定党参茎基腐病的病原菌为尖孢镰刀菌。菌株DS-4的GenBank号为OP164704。

2.4 不同杀菌剂对党参茎基腐病的田间防治效果

由表2可知，清水处理下党参茎基腐病的发生率達95%，且病情指数较高达98。5种药剂处理下，党参茎基腐病的病害发生率和病情指数均有所下降。其中，多菌灵600倍液处理下的病害发生率最低为28%，病情指数为18，防治效果达81.63%；其次是甲霜灵500倍液处理下的病害发生率为35%，病情指数为25，防治效果达74.49%。而另外3种药剂处理，党参茎基腐病的病害发生率均高于56%，防治效果36.73%～51.02%。

3 结论与讨论

贵州道真地区春季湿热多雨，党参4—5月处于幼苗时期，易受病害的侵染，而对病害的有效防治必须要准确掌握引起病害的病原菌［10］，故该研究对贵州道真党参的茎基腐病致病菌进行分离纯化、致病性检测，并通过形态学和分子生物学技术进行分析，确定引起党参茎基腐病的主要致病菌为尖孢镰刀菌。尖孢镰刀菌是农业生产中土传病害的重要病原菌之一，具有很强的寄生和腐生能力，目前已报道的党参病害中，尖孢镰刀菌是根腐病病原菌的优势菌种［11-13］。该试验中，选取5种常用化学药剂对党参茎基腐病进行简单的防治，结果表明，多菌灵对党参茎基腐病的防治效果较好，为党参茎基腐病的田间防治提供理论依据。但需要注意的是，该研究的防治试验是在发病初期开始连续喷施，进而取得了更好的防治效果。不同地区应根据病害发生规律，在早期予以施药。此外，需要注意在病害防治过程中，长期且单一地使用同一种化学药剂进行病害防治，病原菌可能会对其产生抗性，防治效果会逐渐减弱，故在实际生产中，应多种药剂交替使用，且发现病株以后，应及时对病害侵染地进行消杀工作，防止其进一步扩大。

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