响应曲面法优化黑皮鸡枞液体配方研究

黄静 李鹏 和耀威 刘忠玄 向准

摘要 ［目的］以贵州省生物研究所保藏的黑皮鸡枞“HP1号”菌株为研究对象，研究不同营养物质对黑皮鸡枞菌丝生长的影响。［方法］采用单因素试验和响应曲面法试验对黑皮鸡枞的营养需求进行优化。［结果］黑皮鸡枞最佳碳源为玉米粉，最佳氮源为酵母膏，维生素B1最适含量为10.0 mg/L。［结论］适宜黑皮鸡枞液体培养的最佳配方为玉米粉24.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，磷酸二氢钾2.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，维生素B1 10.0 mg/L。

关键词 黑皮鸡枞；生物量；响应曲面法

中图分类号 S646  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2023）13-0049-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.13.012

Study on Optimization of Liquid Formula of Oudemansiella Radicata by Response Surface Method

HUANG Jing， LI Peng，HE Yao-wei et al

（Guizhou Institute of Biology，Guiyang，Guizhou  550009）

Abstract ［Objective］The effect of different nutrients on the mycelial growth of O.radicata was studied with the strain ‘HP1 of O.radicata preserved in Guizhou Institute of Biology. ［Method］The single factor test and response surface methodology were used to optimize the nutritional requirements of O.radicata.［Result］The optimum carbon source of O.radicata was corn meal， the optimum nitrogen source was yeast extract， and the optimum content of vitamin B1 was 10.0 mg/L. ［Conclusion］The optimum formula suitable for the liquid culture of O.radicata was corn meal 24.0 g/L， yeast extract 5.0 g/L， potassium dihydrogen phosphate 2.0 g/L， magnesium sulfate 1.0 g/L， vitamin B1 10.0 mg/L.

Key words O. radicata;Biomass;Response surface method

基金项目 贵州省食用菌现代农业产业技术体系建设（GZCYTX2023-03）。

作者简介 黄静（1993—），女，贵州遵义人，研究实习员，硕士，从事食用菌栽培与病虫害防控研究。通信作者，副研究员，硕士，从事食用菌栽培示范推广研究。

收稿日期 2022-11-29

黑皮鸡枞（O.radicata sensu Horak；Fide Segedin & P ennycook）属于白蘑科小奥德蘑属，又名长根奥德蘑、长根金钱菌、长根菇、长寿菇等［1-2］，是新近商业化栽培的热点食用菌之一。黑皮鸡枞香味馥郁，肉质鲜美，富含氨基酸、多糖、礦物质元素及蛋白质等多种营养成分［3］，具有较高的药用价值，具有健脾益气、降血压、抑制肿瘤等功效［4-5］，是一种珍稀食药用菌。黑皮鸡枞属中高温型真菌，主要分布在亚热带与北温带地区［6］。黑皮鸡枞在2006年实现人工栽培［7］，经过不断优化菌种技术及栽培技术，已初步实现规模化栽培［8］。由于我国黑皮鸡枞栽培历史相对较短，菌种配方不稳定，菌种活力弱，导致规模化生产可重复性差、病虫害严重、产量低等问题［9-10］。因此，笔者通过在前期对黑皮鸡枞液体培养基单因素优化的基础上，进一步明确培养基中的碳源、氮源和维生素的含量；通过响应曲面优化设计试验研究各成分之间的相互作用，从而获得最佳的液体培养基配方，旨在为黑皮鸡枞的规模化生产提供优质菌种的同时，也为黑皮鸡枞的品种选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株黑皮鸡枞“HP1号”由贵州省生物研究所提供。

马铃薯综合培养基：去皮马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，蛋白胨3.0 g，KH2PO4 2.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，维生素B1 10.0 mg，琼脂粉20.0 g，水1 000 mL。

供试培养基：葡萄糖20.0 g，蛋白胨3.0 g，KH2PO4 2.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，水1 000 mL。

1.2 试验方法

1.2.1 培养条件。

1 000 mL摇瓶装液量400 mL，振荡培养箱转速165 r/min，培养温度25 ℃，培养周期8 d。

1.2.2 生物量测定。

选择过滤网抽滤去掉培养液，用蒸馏水清洗菌丝体表面并滤掉洗液，重复4～6次，洗净的菌丝体用烘箱60 ℃烘干至恒重，称重［11］。

1.2.3 单因素试验。

①碳源对黑皮鸡枞菌丝生长的影响。选用玉米粉、蔗糖、红糖、果糖、小麦粉、可溶性淀粉、D-木糖7种物质为碳源，按配比加入培养基，以葡萄糖为对照，制作液体培养基，在0.12 MPa、121 ℃下灭菌30 min。3次重复。②氮源对黑皮鸡枞菌丝生长的影响。选用黄豆粉、麦麸、牛肉膏、谷氨酸、酵母膏、豆粕粉6种物质为氮源，按配比加入培养基，以蛋白胨为对照，制作液体培养基，在0.12 MPa、121 ℃下灭菌30 min。3次重复，测定菌丝生物量。③生长因子维生素B1对黑皮鸡枞菌丝生长的影响。以葡萄糖20.0 g、蛋白胨3.0 g、KH2PO4 2.0 g、MgSO4·7H2O 1.0 g、水1 000 mL作为该试验的基础培养基，分别添加不同含量的维生素B1，测定其菌丝生物量。

1.2.4 响应曲面法优化。

利用响应曲面法优化［12-13］（表1），在上述单因素试验基础上，分别选取碳源（A）、氮源（B）和维生素B1（C）3个因子为试验对象，在单因素试验的基础上，以玉米粉作为碳源、酵母膏作为氮源、维生素B1作为生长因子，菌丝体干重为响应值，采用响应曲面法确定黑皮鸡枞液体培养的最佳营养条件。

1.3 数据统计与分析

试验数据均利用 SPSS Statistics 18和design-expert 8.0.6进行统计分析（P<0.05），并利用软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 不同碳源对黑皮鸡枞菌丝量的影响。

由表2可知，7种碳源中，黑皮鸡枞菌丝对玉米粉的利用最好，菌丝干重达8.67 g/L，菌丝萌发最快，菌球直径为3～5 mm，密度大且菌液澄清；其次是小麦粉和蔗糖，菌丝萌发较快，菌球直径为4～8 mm、密度中等，以小麦粉为碳源时，菌液有点浑浊；对葡萄糖、蔗糖等其他碳源的利用相对较差。菌丝萌发时间稍长，菌球大、密度低。说明黑皮鸡枞菌丝生长的最适碳源为玉米粉。

2.1.2 不同氮源对黑皮鸡枞菌丝生物量的影响。

由表3可知，在所选氮源中，黑皮鸡枞菌丝对酵母膏的利用率最高，菌丝干重达8.75 g/L，菌丝萌发最快，菌球直径为4～6 mm，大小均匀，密度高；其次麦麸、豆粕粉、蛋白胨，菌球大小比较均匀、密度中等；对谷氨酸的利用最差，菌丝萌发需要时间最长，生成的菌球偏大、不均匀且密度低。综上所述，黑皮鸡枞菌丝生长的最适氮源为酵母膏。

2.1.3 不同维生素B1含量对黑皮鸡枞菌丝生物量的影响。

由图1可知，维生素B1对黑皮鸡枞菌丝的生长没有决定性的营养作用，但适当添加维生素B1，可在一定程度上促进菌丝的生长，当维生素B1在培养基中含量增加到10.0 mg/L时，菌丝干重达到最高为9.3 g/L；菌丝萌发较快，菌球中等，大小较均匀，菌液清澈，密度中等；当维生素B1在培养基中的含量增加到15.0 mg/L时，菌丝干重开始缓慢下降为8.63 g/L。因此，确定维生素B1的含量为10.0 mg/L。

2.2 响应面优化试验结果

由表4可知，以A、B和C为响应变量，以Y值为响应值对表4数据进行处理，得到表5方差分析表，利用Design-Expert 8.0.6软件进行二次多项式拟合，得到预测模型：

R1=+11.31+0.88A+0.33B-0.25C+0.92AB-0.39AC+0.15BC-1.11A2-1.10B2+0.64C2

表5结果表明，A-A、B-B、AB、A2、C2和B2项差异极显著，C-C和AC项差异显著，BC项差异不显著。模型P值<0.000 1，可信度水平大于99.99%，说明该模型有意义，所拟合的回归方程合适。复相关系数R2=0.986 1，表明相关性好，该模型失拟值P值0.395 8>0.05，失拟值不显著，说明试验可信。另外从F值可以看出，3个因素对菌丝生物转化率的影响顺序为A>B>C，即玉米粉>酵母膏>维生素B1。

利用回归方程分析黑皮鸡枞菌丝的干重和各因素变化的响应曲面图。由响应曲面图可知，玉米粉、酵母膏和维生素B1各因素对菌丝干重的影响。每个响应面表示2個独立因素之间的交互作用，另一个因素保持在0水平编码。

玉米粉质量浓度与酵母膏质量浓度两因素的交互作用极显著，在酵母膏质量浓度较高时，随着玉米粉质量浓度升高，黑皮鸡枞菌丝干重迅速上升至平缓，随后下降；在酵母膏质量浓度较低时，随着玉米粉质量浓度升高，黑皮鸡枞的菌丝干重缓慢上升至平稳，随后下降；在玉米粉质量浓度较高时，随着酵母膏质量浓度上升，黑皮鸡枞菌丝干重缓慢上升至平稳，随后下降；在玉米粉质量浓度较低时，黑皮鸡枞菌丝干重缓慢上升至平稳，随后略有下降（图2）。

玉米粉质量浓度与维生素B1含量两因素的交互作用极显著，在维生素B1含量较低时，随着玉米粉质量浓度升高，黑皮鸡枞菌丝干重缓慢上升至平缓，随后略有下降；在维生素B1含量较高时，随着玉米粉质量浓度升高，黑皮鸡枞菌丝干重缓慢上升至平缓，随后迅速下降；在玉米粉质量浓度较低时，随着维生素B1含量升高，黑皮鸡枞菌丝干重均缓慢上升；在玉米粉质量浓度较高时，随着维生素B1含量升高，黑皮鸡枞菌丝干重呈缓慢下降趋势（图3）。

3 结论与讨论

黑皮鸡枞是一种含有丰富营养价值的食用菌，是近年来比较热门、栽培前景广的商业化栽培食用菌。在西南地区有小规模栽培，存在产量少、质量不稳定、人工成本高等问题，远不能满足当地市场的需求。其中菌种是制约黑皮鸡枞产业发展的因素之一。

该研究以菌株HP1为试验材料，对其营养需求进行研究，将所得数据通过Design-Expert 8.0.6软件分析得出，影响黑皮鸡枞菌丝生长最佳碳源为玉米粉23.82 g/L，最佳氮源为酵母膏5.22 g/L，最佳维生素B1 10.46 mg/L，为方便试验将优化后的配方调整，得出最优配方为玉米粉24.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，维生素B1 10.0 mg/L。此营养条件下，黑皮鸡枞菌丝体的干重（理论）为11.40 g/L。在此培养条件下进行3次平行重复试验验证，均值为11.39 g/L。与最优值相近，进而说明模型的可靠性良好，拟合度良好。相比现有报道，该研究所得黑皮鸡枞菌丝生物转化率较高，菌丝球小、密度大且大小均匀，同时生产工艺简单且成本低、重复性强，非常适用于黑皮鸡枞的栽培前期准备，提升菌种稳定性和增强抗逆性等，也为黑皮鸡枞高产稳产奠定了基础。

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