基于UPLC对龙血通络胶囊特征图谱及5个成分含量的测定△

孙冬雪，徐忠坤，高云佳*，殷洪梅，张庆英，屠鹏飞

1.北京大学 药学院 天然药物及仿生药物国家重点实验室，北京 100191；2.北京华医神农医药科技有限公司，北京 102206；3.江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001；4.中药制药过程新技术国家重点实验室，江苏 连云港 222001；5.中药提取精制新技术重点研究室，江苏 连云港 222047

龙血通络胶囊是以龙血竭酚类提取物单一投料制成的中成药，具有活血化瘀通络的功效，用于脑卒中恢复期血瘀证，症见半身不遂、口舌歪斜、偏身麻木、脉弦或涩，疗效显著[1-5]。

目前，有关龙血通络胶囊的现行标准和文献报道中有关指纹/特征图谱和含量测定均采用高效液相色谱法（HPLC）[6-9]，含量测定多以7,4′-二羟基黄酮、龙血素A、龙血素B 为指标性成分。HPLC 存在检测时间长、分离效果不理想等缺点，为了能更加全面、高效、准确地评价龙血通络胶囊的质量，本研究采用超高效液相色谱法（UPLC）建立龙血通络胶囊的特征图谱，标定11 个共有特征峰，并同时测定其中5 个成分的含量[10-11]，缩短了检测时间，提高了色谱峰的分离度，全面优化了龙血通络胶囊的质量控制方法。

1 材料

1.1 仪器

H-Class 型超高效液相色谱仪（美国Waters 有限公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BT25S型、BSA124S型、BSA2202S型电子天平（德国赛多利斯公司）；明澈-D型超纯水一体化系统（德国默克密理博公司）。

1.2 试药

龙血通络胶囊由江苏康缘药业股份有限公司提供，13 批样品分别批号为201004、201005、201104、210101、210102、210201、210204、210301、210305、210401、210406、200501、200709，规格为0.33 g/粒，编号为S1～S13。

对照品7,4′-二羟基黄酮（批号：111787-201002，纯度：98.6%）、龙血素A（批号：111660-200402，纯度≥98%）、龙血素B（批号：111558-201407，纯度：99.9%）均购自中国食品药品检定研究院；龙血素C（批号：DST200319-261，纯度≥98%）、4,4′-二羟基-2,6-二甲氧基二氢查耳酮（批号：DST220623-074，纯度≥98%）均购自德斯特生物科技有限公司；紫檀芪（批号：PS2095-0050 MG，纯度>98%）购自成都普思生物科技股份有限公司；7,4′-二羟基-5-甲氧基高异黄烷酮、3,4′-二羟基-5-甲氧基二苯乙烯均为实验室分离制备，纯度均≥98.0%；乙腈、甲醇均为色谱纯；磷酸为分析纯；水为自制超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18色谱柱（150 mm×3.0 mm，2.7 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）为流动相梯度洗脱（0～18 min，24%～33%A；18～26 min，33%～37%A；26～40 min，37%～47%A）；柱温为35 ℃；流速为0.5 mL·min-1；检测波长为280 nm；进样体积为2 μL。

2.2 对照品溶液的制备

取7,4′-二羟基黄酮、4,4′-二羟基-2,6-二甲氧基二氢查耳酮、龙血素A、龙血素B、紫檀芪对照品适量溶于甲醇中，配制成质量浓度分别为50、60、120、80、90 μg·mL-1的混合对照品溶液A。再分别取龙血素C、7,4′-二羟基-5-甲氧基高异黄烷酮、3,4′-二羟基-5-甲氧基二苯乙烯对照品适量溶于甲醇中，配制成质量浓度分别为20、50、40 μg·mL-1的对照品溶液B、C、D。

2.3 供试品溶液的制备

取本品内容物0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理（500 W，40 kHz）30 min，取出，放冷，再称定质量，加75%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 特征图谱的建立及方法学验证

2.4.1 精密度试验 取样品S12 按2.3 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件测定，连续进样6次，记录色谱图中各特征峰的保留时间，以9号峰（龙血素A）为参照峰，以各特征峰的相对保留时间的RSD 为考察指标，结果均小于0.5%，表明仪器的精密度良好。

2.4.2 稳定性试验 取样品S12 按2.3 项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，分别在0、2、4、8、12、24 h 进样，记录色谱图中各特征峰的保留时间，以9号峰（龙血素A）为参照峰，以各共有峰的相对保留时间的RSD 为考察指标，结果均小于0.5%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.3 重复性试验 取样品S12 共6 份，按2.3 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件测定，记录色谱图中各特征峰的保留时间，以9 号峰（龙血素A）为参照峰，以各共有峰的相对保留时间的RSD为考察指标，结果均小于0.5%，表明该方法的重复性良好。

2.4.4 特征图谱的建立 取13 批龙血通络胶囊样品（S1～S13），按2.3 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件测定，记录色谱图和各特征峰的保留时间。

将13 批样品的特征图谱数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012版）软件中，对13批龙血通络胶囊样品进行分析，生成对照图谱（图1）。13 批龙血通络胶囊样品（S1～S13）的色谱与对照图谱的相似度分别为0.999、0.999、0.994、0.999、0.998、0.995、0.995、0.988、0.991、0.992、0.999、0.985、0.975，均大于0.95，表明本品批间质量一致性良好。

图1 龙血通络胶囊的UPLC特征图谱

2.4.5 共有特征峰的指认 取2.2 项下对照品溶液A、B、C、D，按2.1项下色谱条件测定，记录色谱图。通过对照品的保留时间和紫外吸收对比，确定峰1为7,4′-二羟基黄酮、峰5为7,4′-二羟基-5-甲氧基高异黄烷酮、峰6为龙血素C、峰7为4,4′-二羟基-2,6-二甲氧基二氢查耳酮、峰8 为3,4′-二羟基-5-甲氧基二苯乙烯、峰9 为龙血素A、峰10 为龙血素B、峰11为紫檀芪（图1）。

2.5 多成分的含量测定

2.5.1 线性关系考察 精密称取7,4′-二羟基黄酮、4,4′-二羟基-2,6-二甲氧基二氢查耳酮、龙血素A、龙血素B、紫檀芪对照品适量，分别加甲醇溶解，制成质量浓度分别为0.564 0、0.330 0、0.762 0、0.428 0、0.452 5 mg·mL-1的对照品储备液。分别取5 个对照品储备液，制备系列质量浓度的对照品溶液，按2.1 项下色谱条件测定，记录峰面积。以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制线性回归曲线。结果见表1。

表1 龙血通络胶囊中5个成分的线性关系考察结果

2.5.2 精密度试验 取样品S12 按2.3 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件测定，连续进样6 次，记录峰面积。7,4′-二羟基黄酮、4,4′-二羟基-2,6-二甲氧基二氢查耳酮、龙血素A、龙血素B、紫檀芪5 个成分峰面积的RSD 分别为0.07%、0.10%、0.22%、0.35%、0.20%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性试验 取样品S12 按2.3 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件测定，分别在0、2、4、8、12、24 h 进样，记录峰面积。7,4′-二羟基黄酮、4,4′-二羟基-2,6-二甲氧基二氢查耳酮、龙血素A、龙血素B、紫檀芪5个成分峰面积的RSD 分别为0.49%、0.16%、0.27%、0.40%、0.67%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.4 重复性试验 取样品S12 共6 份，按2.3 项下方法制备供试品溶液，再取2.2 项下混合对照品溶液A，按2.1 项下色谱条件测定，记录峰面积，采用外标一点法计算质量分数，7,4′-二羟基黄酮、4,4′-二羟基-2,6-二甲氧基二氢查耳酮、龙血素A、龙血素B、紫檀芪5 个成分的平均质量分数分别为5.11、6.80、15.00、8.63、9.26 mg·g-1，RSD分别为0.43%、0.49%、0.44%、0.59%、0.24%，表明该方法的重复性良好。

2.5.5 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品（S12）约0.1 g，取9份，分别按1∶1.5、1∶1、1∶0.5加入7,4′-二羟基黄酮对照品溶液，按2.3项下方法制备不同质量浓度的供试品溶液，每个质量浓度平行制备3份，按2.1项下色谱条件测定，记录峰面积，计算回收率。参照上述操作，分别计算4,4′-二羟基-2,6-二甲氧基二氢查耳酮、龙血素A、龙血素B、紫檀芪的回收率，结果见表2。

表2 龙血通络胶囊中5个成分的加样回收率试验结果

2.5.6 样品检测 取13 批龙血通络胶囊样品（S1～S13）按2.3 项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，记录峰面积，采用外标一点法计算各成分质量分数，结果见表3。

表3 龙血通络胶囊样品中5个成分的含量测定结果mg/粒

3 讨论

3.1 提取方式的优化

本研究分别考察了供试品的样品量（0.1、0.2、0.5 g）、提取方式（超声、回流）、提取溶剂（水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、甲醇）、提取时间（15、30、60 min）、提取溶剂体积（10、25、50 mL）对龙血通络胶囊特征图谱及含量测定的影响。综合考虑各成分的提取率及操作简便性，最终确定最佳供试品制备方法为取样品约0.2 g，加75%甲醇25 mL，超声30 min。

3.2 色谱条件的优化

本研究采用二极管阵列检测器对龙血通络胶囊样品进行光谱扫描（200～400 nm），各成分色谱峰在280 nm 下均有较好的吸收，故选择280 nm 作为检测波长。通过进一步考察同一型号不同批次的色谱柱（Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱，150 mm×3.0 mm，2.7 μm，批号分别为S.N.USCFW05921、S.N.USCFW16967、S.N.USCFW17761）、流动相系统（乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液）、柱温（25、30、35 ℃）、流速（0.3、0.4、0.5 mL·min-1）、进样体积（1、2、3 μL）对特征图谱和含量测定的色谱条件进行了优化。结果表明，当色谱条件为Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18色谱柱（150 mm×3.0 mm，2.7 μm），以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相梯度洗脱，柱温为35 ℃，流速为0.5 mL·min-1，检测波长为280 nm，进样体积为2 μL 时，色谱信息较全面、各色谱峰峰形好、分离度较好。

3.3 结果分析

本研究采用UPLC 建立的龙血通络胶囊的特征图谱，在40 min 内实现了特征峰的高效分离。分析13批龙血通络胶囊样品，从特征图谱中标定了11个共有特征峰，指认了其中8 个特征峰，13 批样品特征图谱的相似度均大于0.95，说明本品批间质量稳定，一致性良好。在龙血通络胶囊UPLC 特征图谱基础上，综合考虑化学成分的结构特征、含量和分离度，选择其中5 个成分7,4′-二羟基黄酮、4,4′-二羟基-2,6-二甲氧基二氢查耳酮、龙血素A、龙血素B、紫檀芪作为含量测定指标性成分。含量测定结果显示5 个化学成分的含量分别为1.67～1.99、2.14～4.02、4.05～5.31、2.80～3.72、3.04～3.86 mg/粒。

本研究采用UPLC同时测定特征图谱和5个特征成分的含量，缩短了检测时间，提高了色谱峰的分离度，可用于对龙血通络胶囊进行全面、高效、准确的质量评价。